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急性肝衰竭（Acute Liver Failure,ALF）是危及人们生命健康的严重疾病,生物人工肝（Bio-Artificial Liver,BAL）系统为ALF患者的临床治疗带来了新希望。人源诱导性肝样细胞（Human Induced Hepatocytes,hiHeps）是一种由慢病毒介导的从人皮肤成纤维细胞直接转分化而来的肝样细胞,其具有成熟肝细胞正常表型和多种功能,可作为BAL系统潜在种子细胞来源。但要实现BAL系统临床治疗应用,至少需要1010个以上的功能肝细胞数,且这些细胞在成分明确的无血清培养基（Serum Free Medium,SFM）中扩增并获得。然而,目前使用的含商业化血清替代物的无血清培养基价格昂贵且成分不明,难以精准调控hiHep细胞增殖和功能;基于多层平板扩增细胞,成本高、规模难以放大;此外体外培养的hiHep细胞特异性功能和活性尚有待提高。这些问题限制了基于hiHep细胞的BAL系统临床研究和治疗应用。为此,本文通过认识体外培养环境对转分化hiHep细胞的增殖、活性和功能的影响及相关调控机制,建立适于hiHep细胞体外培养的成分明确且无动物源性成分的无血清培养基以及无血清规模化扩增技术,并调控hiHep细胞的增殖、活性和功能,研究结果为构建基于hiHep细胞的BAL系统以及未来临床治疗应用奠定基础。为建立适于hiHep细胞体外培养的成分明确且无动物源性成分的无血清培养基,利用Plackett-Burman（PB）实验设计筛选得到支持hiHep细胞体外生长的初始无血清培养基OM14,通过因子效应分析发现维生素C（VC）、维生素H（VH）和胰岛素这三个效应因子显著影响hiHep细胞增殖。在优化了关键效应因子胰岛素最适工作浓度的基础上,探究其影响hiHep细胞增殖和功能的分子机制。结果表明,胰岛素浓度为1 mg/L时更有利于hiHep细胞增殖和功能相关基因表达,且通过PI3K-Akt1-mTOR-p70S6K信号通路和PI3K-Akt1-P53信号通路介导的Cyclin D1蛋白表达调控hiHep细胞增殖,此外还通过促进转录因子HNF1A的表达,增强hiHep细胞白蛋白（ALB）及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）表达。进一步研究发现,胰岛素处理可维持长期传代过程中hiHep细胞正常形态,促进细胞增殖和肝功能基因稳定表达。通过添加1.5 mg/L VH和30 mg/LVC、降低生长因子TGF-α浓度至10 ng/mL以及将动物源牛血清白蛋白替换为植物源人血清白蛋白,进一步优化无血清培养基,由此建立了一种成分明确、无动物源成分的无血清培养基。在该无血清培养基中培养的hiHep细胞在形态、生长和功能方面与含血清培养基中的结果相当,且细胞损伤程度更低。为建立hiHep细胞无血清微载体培养技术,考察了培养过程中影响hiHep细胞在微载体上的贴附和生长的关键参数,包括微载体类型、接种方式、微载体浓度、细胞接种密度和搅拌转速。研究表明,与Cytopore 2和Cultispher S大孔微载体相比,hiHep细胞在Cytodex 3实心微载体上具有更好的贴附和增殖;且贴壁期采用50%培养终体积接种、微载体浓度为3 mg/mL、细胞接种密度为2.0×105 cells/mL以及搅拌转速为45 rpm时,更有利于hiHep细胞在微载体上的均匀贴附、生长及活性。培养12 d后,hiHep细胞的最终细胞密度可达25.22×105 cells/mL,扩增倍数为12.61倍。此外,研究还发现添加纤粘连蛋白（Fibronectin,FN）显著促进hiHep细胞在Cytodex 3微载体上的附着和增殖,且这种作用由integrin-β1/FAK/ERK/CyclinD1信号途径介导。由此建立了基于转瓶培养系统的hiHep细胞无血清微载体培养技术,采用该技术培养hiHep细胞,在细胞增殖和功能基因表达方面与含血清微载体培养的结果相当,且细胞活性更好;收获的细胞经鉴定,可维持正常的肝细胞多角形形态和功能表达。为改善体外培养的hiHep细胞的特异功能和细胞活性,采用人脐带来源的间充质干细胞（Huma Umbilical Cord-Derived MSCs,hUMSCs）,建立 hUMSCs 和 hiHeps 无血清共培养模型,探究hUMSCs对hiHep细胞功能和活性的影响及相互作用机制。通过考察hUMSCs与hiHeps接种顺序和接种比例对hiHep细胞功能及活性的影响明确了共培养条件,先接种hUMSCs再接种hiHeps,且hiHeps与hUMSCs的共培养比例为1:1/2时,更有利于hiHep细胞尿素合成和细胞活性。基于不同的无血清共培养模型,解析了直接混合共培养时影响hiHep细胞生长和功能的主要因素,研究发现在混合共培养过程中,共培养条件培养基（Co-CM）在促进hiHeps氨清除及减少细胞凋亡方面起主要作用。通过检测Co-CM中胞外基质和细胞因子含量发现,白介素6（Interleukin-6,IL-6）分泌水平显著增加,并证实在共培养过程中hiHeps分泌的TNF-α促进了 hUMSCs分泌IL-6。进一步研究发现,IL-6是调节共培养过程中hiHeps氨清除和凋亡的主要因素,通过 JAK-Stat3-Ref-1 途径介导的 ROS 水平降低,并和 JAK-Stat3-Bcl-2/Bax-Caspase3途径共同降低hiHep细胞凋亡,此外通过JAK-PI3K/Akt-P53-ARG1信号途径增强hiHep细胞的氨清除能力。将 hUMSCs 与 hiHeps 接种在 PET（Polyethylene Terephthalate）纤维支架上进行三维（Three-Dimensional,3D）共培养,考察在无血清条件下3D共培养时hiHeps功能表达情况。结果表明,与2D单培养组相比,在3D培养环境中hiHep细胞肝特异性功能、Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶活均明显提高,且3D共培养时hiHep细胞白蛋白表达、尿素合成以及UGT酶活进一步增强。随后,构建了基于PET纤维支架的3D灌注动态共培养系统,并比较了 3D静态共培养、3D灌注单培养和3D灌注共培养过程中hiHep细胞的肝功能和细胞活性情况,结果表明,3D灌注共培养条件下hiHep细胞的白蛋白表达和尿素合成水平更高,且细胞活性更好。可见,采用无血清共培养策略可以改善hiHep细胞的功能和活性。综上所述,本文通过设计和优化得到一种适于体外hiHep细胞培养和扩增的成分明确且无动物源成分的无血清培养基,建立了基于hiHeps的无血清微载体细胞扩增技术和无血清细胞共培养技术,在认识了 hUMSCs与hiHeps之间相互作用的分子机制,进一步构建了体外3D灌注动态共培养体系,改善了 hiHep细胞的功能和活性。研究结果为体外调控hiHep细胞无血清规模化扩增和功能维持以及未来基于hiHep细胞的生物人工肝系统的建立和临床治疗应用奠定了理论基础,具有重要的策略指导意义。