小泛素样蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)在调节蛋白质功能和定位中发挥重要作用。SUMO化修饰(SUMOylation)是一个动态可逆的共价修饰过程,可被SUMO特异性半胱氨酸酶(SUMO-specific cysteine proteases,SENPs)逆转。SENPs在维持SUMO修饰的动态平衡、保障细胞和机体正常生理功能中具有重要意义;而SENPs异常表达可破坏体内的SUMO平衡,引起肿瘤的发生和发展。目前已经证实,前列腺癌病人体内SENP1表达上调,而干涉SENP1可以抑制高转移特性前列腺癌细胞的骨转移,但其机制尚不明确。转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGF?)是肿瘤细胞上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)的有效诱导剂;而EMT可促进肿瘤的进展和转移。SMAD4作为重要的肿瘤抑制分子,是TGF-β/SMADs生长抑制信号的关键分子;已有研究证实,SMAD4失活与前列腺癌的发生与发展密切相关。SMAD4含有两个SUMO位点,SUMO修饰可以避免其被泛素化降解,从而增强胞内SMAD4的表达水平和稳定性。进一步研究表明,SUMO修饰的SMAD4不但可以增强TGFβ/SMAD4介导的转录活性,还能负调控雄激素受体等转录因子。因此,SMAD4的SUMO修饰可能参与前列腺癌的发生、发展和转移过程。TGFβ/SMADs信号通路的关键分子SMAD4受到SUMO化修饰的调控,而TGF-β是EMT的有效诱导剂。因此,我们假设前列腺癌细胞内高表达的SENP1可通过调控SMAD4的去SUMO化影响EMT,进而促进肿瘤的发生、发展和转移。本课题旨在阐释SENP1调控TGF-β/SMADs信号并影响前列腺癌细胞生物学性能和EMT的作用与机制,探索前列腺癌治疗的新靶点和新策略。首先,我们设计并构建了重组慢病毒载体PLKO.1-shSENP1,用于在高转移特性的前列腺癌细胞中干涉SENP1的表达;此外,我们构建了重组腺病毒载体Ad-SENP1,用于在低转移特性的前列腺癌细胞中高表达SENP1蛋白。具体为:(1)慢病毒载体构建:(1)设计并合成SENP1的干涉序列(shSENP1)及对照序列(shScramble),将其构建到PLKO.1载体上,获得PLKO.1-shSENP1/shscramble,通过慢病毒包装的三质粒系统包装,获得重组慢病毒PLKO.1-sh SENP1/shscramble;(2)PEG沉淀法纯化病毒,得到感染滴度分别为6.4×108TU/mL的PLKO.1-shSENP1,和6.8×108TU/mL的PLKO.1-shscramble;(2)腺病毒载体构建:(1)将SENP1编码序列构建到穿梭质粒pShuttle-cmv,得到穿梭质粒pShuttle-cmv-SENP1;(2)采用Adeasy系统,制备得到复制缺陷型腺病毒Ad-SENP1和对照病毒Ad-null;(3)氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,获得高质量的病毒产品,分别为:Ad-SENP1(2.5×1010IU/mL),Ad-null(2×1010IU/mL)。其次,采用20MOI慢病毒载体PLKO.1-shSENP1和对照病毒PLKO.1-sh Scramble感染具有高度转移特性的激素非依赖性前列腺癌细胞PC3M和PC3,检测前列腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移能力;检测上皮-间质转化相关分子的表达,包括E-cadherin、Vimentin等;检测TGF-β/SMADs信号通路相关分子,如SMAD2/3及其磷酸化水平,SMAD4表达、受SMAD4调控的相关基因的表达,如P53、P21WAF/Cip1、VEGF、HIF1?等。具体为:(1)PLKO.1-shSENP1感染PC3M细胞后,流式细胞检测结果显示SENP1干涉能够抑制前列腺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡(与PLKO.1-shscramble组相比,p<0.01);划痕实验结果显示,SENP1干涉能有效抑制PC3M细胞的迁移能力(与PLKO.1-shscramble组相比,p<0.01);(2)Western-blotting检测结果显示,PLKO.1-shSENP1可下调Vimentin的表达(与PLKO.1-shscramble组相比,p<0.01),并上调E-cadherin的表达(与PLKO.1-shscramble组相比,p<0.01),提示SENP1干涉能够抑制PC3M细胞的EMT;(3)同时,western-blotting结果显示,SENP1干涉能够上调PC3M细胞中SMAD2/3和SMAD4蛋白表达水平;但是,real-time结果显示,干涉SENP1能够下调SMAD2/3和SMAD4的mRNA表达(与PLKO.1-shscramble组相比,p<0.001);上述结果提示,SENP1可在转录后水平影响SMAD2/3和SMAD4的表达。(4)在PC3M细胞中,干涉SENP1能减少与肿瘤转移密切相关的基因,如VEGFA、HIF-1?在mRNA水平的表达(与PLKO.1-shscramble组相比,p<0.001)。此外,在PC3细胞中,干涉SENP1也能有效抑制肿瘤细胞的EMT。再次,在具有低转移活性的激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP中,采用10MOI重组腺病毒载体Ad-SENP1和对照病毒Ad-Null感染细胞后,分别采用Western-blotting和real-time检测上皮-间质转化相关分子、TGF-β/SMADs信号通路相关分子和受SMAD4调控的相关基因的表达水平。具体为:(1)Ad-SENP1感染LNCa P细胞后,western-blotting结果显示,Ad-SENP1可介导SENP1在LNCaP细胞中高效表达,同时下调SMAD2/3和SMAD4蛋白的表达;然而,SENP1高表达可上调LNCaP细胞中SMAD2/3和SMAD4的mRNA表达水平(与Ad-null组相比,p<0.001);(2)过表达SENP1能下调E-cadherin表达,并上调Vimentin表达,表明SENP1可促进LNCaP细胞的EMT;(3)同时,过表达SENP1还能上调HIF-1?并下调促凋亡基因的表达(与Ad-null组相比,p<0.001)。上述结果提示,SENP1高表达可促进前列腺癌细胞的EMT和转移。最后,我们构建了SMAD4高表达载体和SUMO化位点突变载体,将其转导SENP1高表达的前列腺癌细胞,检测SMAD4表达和转录活性,以及对细胞EMT的影响;同时,采用SMAD4干涉载体转导SENP1干涉的前列腺癌细胞,检测SMAD4表达和转录活性,以及对细胞EMT的影响。(1)pcDNA3.0-SMAD4和pcDNA3.0-mutSMAD4的构建:(1)合成SMAD4编码框序列,并将其克隆到pcDNA3.0载体上,获得pcDNA3.0-SMAD4;(2)设计突变位点(K51R,K159R),采用重叠PCR扩增,获得具有突变位点的SMAD4序列,将其克隆到pcDNA3.0载体上,获得pcDNA3.0-mutSMAD4。(2)SENP1对SMAD4去SUMO化的影响:将pcDNA3.0-SMAD4或pcDNA3.0-mut SMAD4转染LNCaP细胞后24h,采用重组腺病毒Ad-SENP1或Ad-Null感染LNCaP细胞,Western-blotting检测相应蛋白的表达水平。结果显示,SENP1可以下调SMAD4的蛋白表达,而突变的SMAD4能够抑制SENP1对E-cadherin的下调作用,说明SENP1可能通过SMAD4调控E-cadherin的表达。(3)将特异针对SMAD4的干涉RNA(siRNA)转染PC3M细胞(SENP1干涉)后,western-blotting检测SMAD4、E-cadherin和Vimentin的表达水平。结果表明,干扰SMAD4能够抑制SENP1干涉对E-cadherin、Vimentin的影响(与shRNA-NC组相比,p<0.01)。上述结果表明,SENP1能够通过调控SMAD4的SUMO修饰影响SMAD4的表达水平,进一步调节E-cadherin和Vimentin的表达水平,促进肿瘤的EMT和转移。综上所述,我们以本实验室建立的重组慢病毒和腺病毒制备体系为平台,成功构建并制备了干涉SENP1表达的慢病毒载体PLKO.1-shSENP1和高表达SENP1的腺病毒载体Ad-SENP1。在具有高度转移特性的前列腺癌细胞中,干涉SENP1能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡、激活TGF-β/SMADs信号通路,抑制肿瘤细胞的EMT;而SMAD4干涉,能够消除SENP1对EMT相关分子的影响,表明SENP1通过SMAD4抑制肿瘤细胞的EMT。而在具有低转移特性的前列腺癌细胞中,高表达SENP1能够下调SMAD4的表达,促进肿瘤细胞EMT;而SUMO修饰位点突变的SMAD4,能够抑制SENP1诱导的肿瘤细胞EMT,表明SENP1通过对SMAD4的去SUMO修饰促进EMT的发生。上述研究结果表明,SENP1是晚期高转移性前列腺癌的潜在治疗靶点,本研究为进一步探讨前列腺癌新的治疗策略提供了实验依据。