手足口病(hand, foot, and mouth disease, HFMD)是一种以发热及手、足、口腔等部位出现疱疹为主要的临床特征的儿童常见传染病。绝大部分儿童感染后的病情较轻,但少部分患儿会出现比较严重的神经、呼吸和循环系统的并发症,甚至死亡。近几十年在亚太地区频繁暴发高致病性和高死亡率的手足口病疫情,已成为严重威胁儿童健康的一种疾病。研究表明近几十年引起手足口病疫情的主要病原是肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)及柯萨奇A16病毒(Coxsachievirus A16, Cox A16),由于EV71具有中枢神经亲嗜性,部分EV71感染患者会出现神经系统并发症(无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等)以及全身性并发症(多器官衰竭、休克、DIC等),是手足口病的主要致死原因,因而EV71成为科学家研究的热点。EV71属小核糖核酸病毒科,病毒由四种衣壳蛋白(VP1-VP4)组成的衣壳包裹RNA核心所构成。VP1、VP2和VP3衣壳蛋白位于病毒衣壳的外表面,因而病毒的中和表位主要位于这三个蛋白上。VP4蛋白位于病毒表面内侧,可能与维持病毒结构有关,尚无中和表位发现。由于VP1和VP4基因相对保守,目前按VP1和(或)VP4基因对EV71病毒进行分型,分A, B1-B5、C1-C5,共11个基因亚型,中国大陆自1997年后只有C4亚型流行。目前针对肠道病毒EV71感染尚无有效的预防治疗药物,因而寻求预防和治疗EV71感染的药物和研制EV71疫苗正成为国内外学者共同关注的课题。临床研究表明给予患者输注免疫球蛋白可以改善病情。但是输注免疫球蛋白存在感染血液传染病的风险,并且商品化的免疫球蛋白很难保障批次间质量的一致性。使用高中和活性的单抗可以避免这些问题。因而制备高中和活性的EV71单抗可以为EV71治疗提供新的思路。由于EV71感染所致的重症手足口病会留下后遗症,所以开发EV71疫苗是目前控制EV71疫情,减少疾病死亡率、致残率的最佳策略。诱导中和抗体的产生的能力是评价疫苗的效果的重要指标。目前在EV71研究中公认的中和实验方法是基于细胞病变的中和实验(cytopathic effect based microneutralization test, CPE-MNT),这种方法存在耗时耗力,结果不够客观等缺陷,不适合用于大批量检测。因而亟需建立简便、快速、客观的适合高通量检测的新方法。前期我们实验室以EV71病毒(C4亚型)和重组VP4蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤细胞法制备了一批针对EV71的抗体。为进一步明确这些单抗所针对的靶标,采用酵母展示技术构建了分别表达VP1、VP2、VP3和VP4蛋白的重组酵母,鉴定出一组针对EV71衣壳蛋白的单抗；利用经典中和实验筛选出具有中和活性的EV71单克隆抗体；另外我们建立了一种基于ELISA检测的简便、快速、客观的高通量的EV71中和实验方法。进而为研究EV71病毒衣壳的抗原结构及功能以及疫苗制备提供实验依据。研究内容包含三个部分：第一部分：酵母展示技术表达EV71的四种衣壳蛋白酵母表面展示技术以其较为完善的蛋白质翻译后修饰和分泌机制、安全无毒等独特的优越性,近年来颇受关注,已成为蛋白质工程研究的功能平台。本研究应用pYD1EBY100酵母展示系统将EV71的VP1、VP2、VP3和VP4四种衣壳蛋白展示在EBY100酿酒酵母表面：根据EV71(GZR)基因序列信息设计引物,经PCR扩增获得VP1、VP2、VP3和VP4基因片段,利用双酶切和连接将目的片段定向插入到pYD1质粒中,构建了重组的VP1-pYD1、VP2-pYD1、VP3-pYD1和VP4-pYD1重组质粒。将该重组质粒转化到EBY100酿酒酵母中,在半乳糖的诱导下目的蛋白以"Xpress-目的蛋白-6xHis"融合蛋白形式在酵母表面表达。用Xpress单抗或His单抗检测目的蛋白的表达情况,在诱导后48h,50-60%酵母细胞表面可检测到目的蛋白的表达,之后阳性酵母所占比例不再升高。我们应用48h诱导的这些重组酵母建立了基于流式检测的单抗鉴定方法。由于酵母展示的蛋白接近天然蛋白,整个检测过程不会使蛋白变性,因而理论上该方法不仅可以鉴定识别线性表位的EV71单抗,还可以鉴定识别构象表位的单抗。第二部分：肠道病毒71型P1蛋白单克隆抗体的鉴定为明确前期我们实验室制备的20株EV71单克隆抗体所针对的抗原,本文应用免疫荧光(immunofluorescent assay,IFA)，免疫印迹和酵母展示技术联合流式检测方法对单抗进行鉴定。我们复苏冻存的杂交瘤细胞,接种到小鼠腹腔制备EV71单抗的腹水,采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行对抗体进行纯化。随后采用免疫荧光、免疫印迹和第一部分所建立的流式鉴定方法对这些单抗进行鉴定。IFA检测显示所有的20株单抗均能与EV71感染细胞结合,而不与正常细胞反应,提示这些单抗是特异性EV71单抗；在免疫印迹检测中,5株单抗(M-5、M-8、M-12、M-14、M-18)与VP1重组蛋白特异性结合,3株单抗(M-3、M-10、M-13)与VP2重组蛋白特异性结合,1株单抗(M-1)与VP4重组蛋白特异性结合,提示这些单抗是识别相应蛋白的单克隆抗体,它们均识别线性表位。在流式检测中,4株单抗(M-5、M-8、M-14、M-26)与VP1重组酵母特异性结合,3株单抗(M-3、M-10、M-13)与VP2重组酵母特异性结合,1株单抗(M-1)与VP4重组蛋白特异性结合,M-12与VP1重组酵母及VP2重组酵母均有结合,M18与四种重组酵母均不结合；流式与免疫印迹两种方法对7株单抗鉴定的结果一致,3株单抗的鉴定结果有出入。M-26可特异性与VP1重组酵母结合,而在免疫印迹中它不与重组的VP1蛋白结合,说明该抗体可能针对天然VP1蛋白上的构象型表位。M-18与VP1重组蛋白结合的,而不与VP1重组酵母结合,可能该抗体识别的线性表位位于天然蛋白的内部。令人疑惑的是M-12单抗与VP1和VP2重组酵母均可结合,而仅与重组VP1蛋白结合,具体原因还有待进行一步研究。用经典的CPE-MNT测定这20株单抗对EV71的中和活性,共筛选到3株有中和活性的单抗,均为VP1单抗。其中2株中和活性较强的EV71单抗,可作为候选的治疗性EV71单抗应用。第三部分：肠道病毒71型快速VP1-ELISA中和实验的建立参考文献,我们建立了一种基于ELISA检测的EV71VP1蛋白的中和实验方法,ELISA中和实验(ELISA based microneutralization test, ELISA-MNT),其基本原理是：VP1蛋白是EV71病毒的结构蛋白,EV71感染细胞后合成VP1蛋白与病毒的增殖呈正相关。将感染EV71的细胞进行固定,再利用抗VP1的单抗进行直接ELISA检测病毒对细胞的感染情况。本研究以人横纹肌肉瘤细胞(Rhabdomyosarcoma Cell, RD)为病毒感染靶细胞,通过优化感染病毒量和检测抗体浓度,建立了感染24h后快速检测的ELISA-MNT.实验步骤如下：将系列稀释的抗体或血清与等量的1：1000稀释病毒液(3.16×104TCID50)孵育1小时,感染24h后固定细胞,以VP1单抗(AC17B6-HRP)进行ELISA检测,以抗体或者血清检测孔中A450值小于0.5倍病毒对照孔A450的抗体或者血清最高稀释度作为抗体或血清的中和效价,中和效价>10认为具有中和活性,反之无。我们以CPE-MNT为金标准,对ELISA-MNT进行评估。两种方法分别测定20株EV71单抗和19份人血清的中和活性,结果显示ELISA-MNT的灵敏度为92.9%,特异度为100%。具有中和活性的3株单抗和10份血清的中和滴度检测结果显示两种方法测定中和抗体滴度的相关性良好(r=0.934,P<0.001)。此外,ELISA-MNT方法较CPE-MNT相比,时间大大缩短(2天完成检测)。综上所述我们所建立的这种ELISA-MNT方法,省时省力,适合高通量检测EV71中和抗体。小结：根据以上三个部分的研究,本研究小结如下：1.构建了EV71衣壳蛋白酵母展示系统,成功地获得了能表达EV71衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的重组酵母菌。利用重组酵母菌建立了鉴定EV71单抗的流式检测方法,为鉴定EV71P1蛋白的单抗,特别是识别构象表位的P1单抗建立了良好的实验平台。2.应用IFA、免疫印迹、酵母展示技术联合流式检测方法鉴定了前期制备的20株鼠源性EV71单克隆抗体,鉴定出6株VP1单抗,3株VP2单抗,1株VP4单抗。3.免疫印迹与酵母展示技术联合流式检测方法鉴定单抗的结果一致性较好。4.获得三株具有较强的中和活性的EV71VP1单抗M-5、M-8和M-14,有望作为候选的治疗性单抗应用。5.建立了一种EV71快速VP1-ELISA中和实验。以CPE方法作为金标准,该方法具有较好的灵敏性(92.9%)和特异性(100%)。该方法与传统的细胞病变中和实验的有良好的相关性。该方法检测快速、结果客观,适于高通检测EV71中和抗体。