作为妇科常见且恶性程度极高的肿瘤之一,宫颈癌的发生率和死亡率在我国一直居高不下,我国平均每年有13万左右的新发患者,大概占全球总发病率的1/4~1/3,随着这几年宫颈癌的筛查技术不断进步和人们普查意识的提高,宫颈癌的治疗有效率和早期发现率明显提升,但总的发病率并未明显减少,尤其是其年轻化的趋势越发严重,给生育年龄的妇女带来了生理和生殖上的威胁。宫颈癌的发生到形成是一个多源性、多个步骤、多阶段的过程,如HPV的感染、性行为不良、宫颈糜烂等,针对宫颈癌的预防和治疗方案也主要从上述病因及发生发展过程下手,如HPV疫苗的接种和定期筛查的预防方案,配合手术、药物、基因等治疗方案使得宫颈癌有所遏制,但其仍居我国妇科恶性肿瘤的前三位,5年生存率仍不满意。归因于宫颈癌的发病原因尚不十分明确,治疗的手段有所欠缺,加之人们对于肿瘤治疗的存活质量提出质疑,寻找宫颈癌的分子靶向关键点迫在眉睫。作为泛素特异性水解酶大家族的一员,特异性肽酶22(USP22)在多种恶性肿瘤中都存在表达,它存在于人类基因组的第17个染色体上,包含1578个碱基对,翻译出的蛋白质大部分通过去泛素化的作用,修饰调节细胞内一系列的生物活动,例如促进细胞的生长与分化、调控细胞的增殖周期、活化转录基因、调控信号的转导通路、参与肿瘤的发生发展。有学说强调肿瘤中存着极少数具备不停生长、自我代谢、多种分化潜力的细胞,被定义为肿瘤的干细胞,它们为肿瘤细胞增殖、浸润和转移提供了条件。近几年的研究表明USP22在肿瘤的生长过程中起着关键作用,已经被专家贴上肿瘤干细胞新标签的名字。USP22是人类转录辅助因子复合物(h SAGA)的一个亚单位,可以降解某些组蛋白连接的泛素,从而控制基因复制和表达,进而影响细胞周期,大量研究证实若肿瘤细胞缺乏USP22蛋白,大多表现为生长减慢或生长停滞,使其停留在G1期。近年来USP22在多种恶性肿瘤中高表达均见报道,但USP22在宫颈癌中的表达国内尚并未见报道,并且它作用于肿瘤的具体机制仍不明确。缺氧诱导因子HIF-1是目前研究比较透彻的与细胞组织的乏氧状态有关的关键转录基因。HIF-l是由α和β亚基组成,其中α亚基是氧调节的关键蛋白,决定着HIF-1的活性和特异性,β亚基是基础蛋白,与HIF的稳固性有关。如果细胞生长过快就会使组织置入在缺氧的微环境中,从而诱使α亚基集中然后转移至细胞核,与β亚基组合形成有功能的HIF-1,被活化的HIF-1再结合到目的基因的乏氧反应序列上,继而启动目的基因的表达。正常组织中HIF-1α主要通过泛素化的作用降解,如果移除泛素分子,使其长期保持完整性,那么就会促使下游的靶基因同样高表达,下游靶基因的表达可翻译出各种影响肿瘤发生发展的蛋白,为肿瘤的浸润转移提供保障。目的目前,我国关于USP22与宫颈癌及USP22与HIF-1α的相关性研究尚未见报道,本实验采用免疫组化法和荧光定量聚合酶链法检测宫颈癌、CIN和正常宫颈组织中USP22、HIF-1α的蛋白质和m RNA的表达情况,分析二者在宫颈癌的临床分期、病理分级、淋巴转移等的表达有何不同,同时判断二者在宫颈癌的发生发展中二者之间的相关性,为宫颈癌的早期诊断、生物评估、分子靶向治疗带来新的希望。材料与方法1.材料来源:郑州大学第三附属医院2014年从年初至年末,因宫颈癌采取手术治疗的标本45例,平均年龄49岁,同期在门诊或住院部因CIN行手术治疗标本25例,平均年龄40岁,同期因子肌瘤或子宫内膜疾病行子宫全切标本15例(不除外宫颈炎),平均的年龄是50岁,总共有85个病例。把45个癌症病例经过FIGO分期标准分为两组,Ⅰ期、Ⅱ期分别有20例、25例;根据肿瘤的分化程度从低到到高三级病理分组分别有20例、14例、11例;21例不伴有淋巴结浸润,24例伴有淋巴结浸润;≧50岁有16例,<50岁有29例。全部病例术前都没有接受过化疗或者放疗。取部分标本,用固定浓度的甲醛溶液固定,然后采用石蜡包埋,取大约4μm厚度对蜡块进行连续切片,剩余均保存于-80℃冰箱。所以标本术后均经两位以上资深病理专家确诊。2.实验方法:运用免疫组化及荧光定量PCR法检测宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组、正常宫颈组织中两者蛋白和m RNA表达水平。探讨二者在宫颈癌的发生发展中的作用及二者之间的相关性,可能为宫颈癌的早期的诊断、生物评估、分子靶向治疗带来新的希望。3.统计学方法:采用SPSS 16.0统计学软件,定量资料用sx±表示,采取单因素方差分析、t检验、秩和检验;定性资料采取卡方检验、Fisher’s确切概率法等对数据进行统计学分析;USP22和HIF-1α表达的相关性采取Spearman等级相关分析,以P<0.05定义为差异有统计学意义。结果1.USP22和HIF-1α的表达免疫组化结果示:USP22以细胞核中呈现棕黄色为阳性,HIF-1α以细胞核和细胞质中均呈现棕色颗粒为阳性。荧光定量PCR结果示:观察扩增后的目的基因CT值,ΔCT=CT(目的基因)-CT(内参基因),以ΔCT值代表宫颈组织目的基因的差异性表达,以2-ΔΔCT代表宫各种宫颈组织目的基因表达相对于正常宫颈目的基因的变化倍数。2.不同宫颈组织中USP22和HIF-1α的表达USP22在宫颈癌、CIN、正常宫颈组织的蛋白和核酸表达均逐渐降低,差异均有统计学意义,核酸表达结果提示USP22在宫颈癌和CIN的表达量分别是正常宫颈的5.822倍和2.214倍。HIF-1α在宫颈癌、CIN、正常宫颈组织的蛋白和核酸表达均逐渐降低,差异均有统计学意义,m RNA相对表达量分别为:4.313±3.122、2.305±1.083、1.048±0.315,提示HIF-1α在宫颈癌和CIN的表达量分别是正常宫颈的4.313倍和2.305倍。3.USP22和HIF-1α与宫颈癌患者年龄的关系USP22在≧50岁和<50岁两组的蛋白表达阳性率分别为:56.25%、58.62%,差异无统计学意义(P=0.878);核酸的差异性表达量分别为:3.764±1.361、4.091±1.458,差异无统计学意义(P=0.466)。HIF-1α在年龄分组中两组的蛋白质表达阳性率分别为:68.75%、89.66%,差异无统计学意义(P=0.177);核酸的差异性表达量分别为:4.558±1.06、5.132±1.71,差异无统计学意义(P=0.112)。4.USP22和HIF-1α与宫颈癌临床分期的关系USP22在两组临床分期组的蛋白表达阳性率分别为:50%、64%,期别越高,阳性率越高,但差异无统计学意义(P=0.345);核酸的差异性表达量分别为:4.763±1.326、3.344±1.166,差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α在两组临床分期组的蛋白质表达阳性率分别为:74%、88%,期别越高,阳性率越高,但差异无统计学意义(P=0.459);核酸的差异性表达量分别为:5.573±1.096、4.412±0.931,差异有统计学意义(P<0.05)。5.USP22和HIF-1α与宫颈癌淋巴结转移的关系USP22在没有淋巴结转移和有淋巴结转移的分组中阳性率分别为:38.10%、75%,差异有统计学意义(P<0.05);核酸的差异性表达量分别为:4.904±1.104、3.162±1.142,差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α蛋白在以上分组阳性率分别:66.67%、95.83%,差异有统计学意义(P<0.05);核酸的差异性表达量分别为:5.601±1.004、4.339±0.947,差异有统计学意义(P<0.05)。6.USP22和HIF-1α与宫颈癌病理分级的关系USP22在G1、G2、G3级蛋白表达阳性率分别为:40%、57.14%、90.91%,差异有统计学意义(P<0.05);m RNA的差异性表达量分别为:5.595±0.096、3.71±1.172、2.558±0.772,差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α蛋白在以上分组阳性率分别为:60%、92.86%、100%差异有统计学意义(P<0.05);m RNA的差异性表达量分别为:5.595±0.996、4.841±1.082、3.826±0.477,差异有统计学意义(P<0.05)。7.USP22和HIF-1α与肿瘤大小的关系USP22在肿瘤的直径<4公分和≧4公分组的蛋白表达阳性率分别为:33.33%、74.07%,差异有统计学意义(P<0.05);核酸的差异性表达量分别为:4.869±1.163、3.378±1.261,差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α蛋白在以上分组中的阳性率分别为:61.11%、96.30%,差异有统计学意义(P<0.05);核酸的差异性表达量分别为:5.419±1.124、4.600±1.073,差异有统计学意义(P<0.05)。8.宫颈癌中USP22和HIF-1α表达的相关性免疫组化结果提示,USP22与HIF-1α的表达呈现一致性性,呈正相关(r=0.426,P=0.014);结论1.USP22、HIF-1α的表达随着宫颈病变恶性程度的提高而升高,说明二者可能参与了宫颈病变的恶化过程,促使肿瘤的发生,为肿瘤的浸润和转移提供条件。2.USP22、HIF-1α在宫颈癌的表达呈现高度的一致性,二者可能存在某种相互作用,共同促进了肿瘤的发生、发展。3.联合USP22、HIF-1α检测可作为宫颈癌诊断的新辅助指标,并且有希望把它们作为治疗宫颈癌的新的关键点。