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趋化因子受体是G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor,GPCR）超家族的成员之一。G蛋白偶联受体是一类重要的药物靶点,目前针对GPCR常用的检测方法有放射性配体竞争结合实验及一些依赖于检测G蛋白偶联受体下游信号通路的功能性实验等。Gα16作为Gq家族的成员之一,在受体激活后,可以通过第二信使引起胞内钙离子的释放。本课题基于共表达受体和Gα16蛋白、而测定胞内钙离子信号,分别建立趋化因子受体CCR5和CXCR4的调节剂的高通量筛选模型。1.趋化因子受体CCR5钙流筛选模型的建立和应用,分为三个小部分。第一部分,CHO/CCR5/Gα16稳转细胞株的建立。方法:电穿孔法将编码CCR5和Gα16蛋白的基因导入CHO细胞,利用抗性筛选20天左右挑取单克隆扩大培养至形成细胞株,RT-PCR检测外源蛋白的表达。结果:RT-PCR检测到CCR5和Gα16的表达,我们获得了稳定转染CCR5和Gα16的CHO/CCR5/Gα16细胞株。第二部分,CHO/CCRS/Gα16稳转细胞株上CCR5活性的检测。方法:[（35）S]-GTPγS分别检测CCR5的激动剂RANTES和拮抗剂maraviroc对CCR5的作用。结果:RANTES能呈剂量依赖性地激活CCR5,maraviroc能剂量依赖性地抑制RANTES对CCR5的激活。提示建立的CHO/CCR5/Gα16细胞株上CCR5具有很好的活性。第三部分,钙流筛选模型的建立及应用。方法:（1）将建立的钙流模型分为激动剂和拮抗剂两种模式,分别评价RANTES和maraviroc对受体的作用;（2）分别应用这两种模式检测RANTES和maraviroc的剂量反应性,获得它们的EC50值或IC50值;（3）应用拮抗剂模式评价CCR5拮抗剂先导化合物库中的一系列化合物。结果:（1）RANTES激活CCR5,在激动剂模式中检测到强烈的钙流信号,而在拮抗剂模式中maraviroc抑制RANTES引起的钙流反应;（2）钙流模型获得的RANTES的EC50值及maraviroc的IC50值与传统筛选方法得到的结果具有很好的一致性,提示我们建立的钙流模型可用于CCR5调节剂的高通量筛选;（3）获得44个对CCR5有较强抑制作用的化合物,再用钙流模型检测它们的剂量反应性,得到的IC50值与[（35）S]-GTPγS结合实验测得的结果相当且均接近于阳性对照maraviroc。2.趋化因子受体CXCR4钙流筛选模型的建立,分为三个小部分。第一部分,CHO/myc-CXCR4/Gα16稳转细胞株的建立。方法:电穿孔法将编码myc-CXCR4和Gα16蛋白的基因导入CHO细胞,利用抗性筛选20天左右挑取单克隆扩大培养至形成细胞株,免疫荧光染色实验检测定位在细胞膜上的受体。结果:在获得的稳转细胞株上,免疫荧光染色检测到CXCR4定位于细胞膜上。第二部分,CHO/myc-CXCR4/Gα16稳转细胞株上CXCR4活性的检测。方法:[（35）S]-GTPγS和钙流实验检测CXCR4激动剂SDF-1对CXCR4的作用。结果:两种实验上SDF-1都剂量依赖性地激活CXCR4,且两种实验获得的SDF-1的EC50值较为吻合。提示建立的CHO/myc-CXCR4/Gα16细胞株上CXCR4具有很好的活性。第三部分,CHO/myc-CXCR4/Gα16细胞株上CXCR4内吞、脱敏等信号通路相关事件的探讨。方法:（1）免疫荧光染色实验检测SDF-1刺激后引起CXCR4的内吞;（2）钙流实验检测SDF-1处理不同时间后CXCR4的脱敏情况;（3）Western blot检测SDF-1处理不同时间后CXCR4总蛋白的表达量情况。结果:（1）CXCR4受到SDF-1处理后内吞到胞浆内;（2）SDF-1刺激5分钟至24小时,CXCR4均发生脱敏;（3）SDF-1持续刺激CXCR4三个小时,即可引起CXCR4表达量下调。结论:1.构建了稳定表达外源蛋白趋化因子受体CCR5/CXCR4和Gα16的CHO/CCR5/Gα16和CHO/myc-CXCR4/Gα16细胞株,细胞株中CCR5和CXCR4具有较好的活性。2.基于共表达受体和Gα16蛋白建立了激动剂和拮抗剂的两种钙流实验模型,这两种模式能很好的区分不同配体对受体的激动或拮抗作用。3.应用CCR5拮抗剂模式评价了一系列化合物,得到若干个CCR5拮抗剂供进一步开发研究。4.CXCR4内吞、脱敏等进一步研究显示了CHO/myc-CXCR4/Gα16细胞株上CXCR4功能的完整性。