一、异种生物骨钉的动物实验研究目的:通过大动物实验来观察生物骨螺钉钉在体内的转归,同时比较其与可吸收钉及自体皮质骨钉在生物转归、生物力学性能以及免疫原性反应上的差异,测评这种消毒及去抗原工艺的优劣,评价生物皮质骨螺钉的生物学性能。为临床应用提供理论依据。方法:取成年中国山羊6只,于左后肢股骨髁部制成双髁的横行骨折,内侧髁用2.5mm*15mm的实验松质骨螺钉固定,外侧髁用相同规格的已用于临床的可吸收松质骨螺钉固定,观察术中固定骨折的效果,并于术后12周、24周、36周、48周行X线检查,于术后36周、48周行病理组织学观察,观察双侧螺钉的转归及骨折愈合的情况;将健康成年山羊18只(包括长期观察组的6只),分成实验界面骨螺钉组、消毒牛骨界面螺钉及消毒羊骨界面螺钉组,于各组实验山羊后肢股骨髁部横行植入界面螺钉1枚,于双后肢胫骨平台横行植入界面螺钉各一枚。分别于术后12周及24周各处死实验羊3只,取股骨部的界面骨螺钉进行病理学观察,观察骨螺钉界面的炎症反应、骨螺钉的吸收改建及周围松质骨的变化。进行Lane的组织学评分;测试初始的界面应力载荷,并对双侧胫骨的骨螺钉标本行进行性力学实验,测试的指标包括最大界面应力载荷、界面刚度。以上实验得出的数值结果用SPSS13.0进行统计学分析。结果:各组的实验羊手术切口均一起愈合。长期观察组影像学观察:术后12周、24周,股骨髁骨折线消失,见大量骨痂生长,实验骨钉周围影变模糊,骨钉外形可见;术后36周,骨折区域塑形完成,实验骨钉影变模糊;术后48周,骨钉区域内密度仍高于周围骨组织。组织学观察:术后36周:植入骨钉可见部分皮质骨成份,与周围骨小梁结合紧密。可吸收钉组:松质骨内可见植入物吸收后残留的炎性空洞;术后48周:骨钉组:骨髓腔内可见骨钉皮质骨组织,骨钉组织内哈佛氏管清晰可见。可吸收钉组:炎性空洞仍然存在。界面钉组病理组织学观察:术后12周:实验界面骨钉组局部未见炎性细胞浸润,骨螺纹损坏,骨钉螺柱内可见破骨细胞;消毒牛骨钉组可见大量炎性细胞浸润,纤维包绕明显;消毒羊骨钉见炎性细胞浸润,纤维包绕弱于消毒牛骨钉,局部可见破骨细胞浸润;术后24周:实验界面骨钉组骨螺纹完全吸收破坏,骨钉与周围宿主骨形成明显骨性连接;消毒牛骨钉组纤维包绕明显,破骨细胞少许;消毒羊骨钉见少许炎性细胞浸润,局部可见破骨细胞浸润,骨性连接形成; Lane组织学评分后的各组数据进行统计分析, P<0.01。说明各组间存在明显差异,实验钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。生物力学实验:行初始界面刚度载荷及界面刚度,实验界面骨钉及两组消毒钉间,P>0.05没有明显差异;12周时,P<0.05,有差异,实验钉组>两组消毒钉组,消毒钉组间无明显差异;24周时,P<0.01,有明显差异,实验钉组>消毒羊骨钉组>消毒牛骨钉组。说明随着植入时间延长,实验骨钉与宿主的骨界面应力进一步增强,产生了坚强的骨性连接。以上实验得出的数值结果用SPSS13.0进行统计学分析。结论:生物骨钉经过长期观察能起到骨钉骨折的作用。无毒副反应,不引起免疫排斥反应,能被机体缓慢吸收;生物骨钉的初始力学性能不低于消毒牛骨,且能较长时间保持稳定的力学性能;生物骨钉具有一定的成骨作用,与宿主骨组织结合后,产生了更强的界面力学性能。二.异种生物型骨钉的免疫原性评价目的:通过体外实验,即在人外周血淋巴细胞与骨材料共培养的情况下,初步探讨淋巴细胞的体外活化和增殖的水平的改变,进一步分析异种骨材料的免疫原性及由其引发免疫应答反应的可能性。方法:抽取健康人静脉血若干,离心分离、洗涤,制成人淋巴细胞悬液。CCK-8法检测骨钉材料对淋巴细胞增殖的影响,培养结束后取培养板在酶标仪上测450nm和650nm的吸光度值。CFSE荧光染色技术结合流式细胞术检测分析骨材料对淋巴细胞增殖的影响,细胞培养3天后,获取细胞,上机检测,CFSE为荧光1通道(FL1);数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取并分析;流式细胞术检测分析骨材料对淋巴细胞体外活化的影响,共培养后上机检测,FITC为荧光1通道(FL1),PE为荧光2通道(FL2);数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取并分析。结果:通过CCK-8法检测骨钉材料对淋巴细胞增殖的影响,取得的计量资料用SPSS13.0统计软件分析比较实验中各组与羟基磷灰石对照组的均值的差异,发现不同计量的骨钉材料共培养的淋巴细胞增殖水平与羟基磷灰石组相比没有显著性差异(P>0.05),而与消毒骨材料共培养的淋巴细胞增殖水平较羟基磷灰石组明显升高(P<0.05);流式细胞术检测分析骨材料对淋巴细胞体外活化的影响,结果显示,羟基磷灰石组的淋巴细胞增殖指数为1.02±0.01,仅出现一个亲代峰,无子代增殖峰,未出现CFSE荧光强度减弱,不同浓度(0.5g/mL、1g/mL、2g/mL)的骨材料组淋巴细胞均有一个子代峰形成,但其增殖指数很低,分别为1.04±0.03、1.03±0.02、1.05±0.02,与羟基磷灰石组比较无明显差异(P>0.05);CFSE荧光染色技术结合流式细胞术检测分析骨材料对淋巴细胞增殖的影响表明,实验骨钉材料在体外与异源性免疫细胞共培养的情况下,对异源性免疫细胞的增殖转化没有影响,可以推断骨钉材料具有的免疫原性是非常低的。阴性组与羟基磷灰石共培养的淋巴细胞其CD69的表达率很低,表明T细胞还处于静息状态;与不同浓度(0.5g/mL、1g/mL、2g/mL)的骨材料共培养的淋巴细胞活化状态,与阴性组相比较均无明显差异;而与消毒骨共培养的淋巴细胞其CD69的表达有明显上调。结论:通过去抗原处理实验生物骨钉材料的免疫原性低于未经处理消毒骨。