涡虫是一种非常独特的动物,具有强大的再生能力,因此成为研究再生的良好模式动物。细胞自噬是真核细胞在进化过程中形成的高度保守的分子机制,对于动物个体发育过程中体型重塑及细胞内稳态平衡具有重要的作用。涡虫在再生过程中需要不断进行体型重塑以维持合适的体型比例,这个过程可能涉及自噬和自噬性细胞死亡。为了研究细胞自噬在涡虫体型重塑中的作用,本研究克隆了日本三角涡虫自噬相关基因DjAtg7,通过透射电子显微镜(TEM)观察涡虫自噬的形态学变化,通过原位杂交技术、RNA干扰技术和qPCR技术研究DjAtg7基因的功能,研究结果如下:(1)日本三角涡虫DjAtg7基因克隆及生物信息学分析:DjAtg7基因cDNA序列全长2272 bp,开放阅读框(ORF)2082 bp编码693个氨基酸。通过生物信息学分析显示DjATG7蛋白的基本理化性质,预测此蛋白为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点,无跨膜区,不存在核输出信号,不具有信号肽。SMART分析显示DjATG7具有E1泛素化酶-ATP结合位点和催化活性位点两个保守结构域。DjATG7系统进化树表明,涡虫与脊椎动物的亲缘关系比与节肢动物的关系更近。(2)日本三角涡虫DjAtg7基因表达模式分析:qPCR检测涡虫切割后再生0,1,3,5,7,10天时DjAtg7基因表达的动态变化,结果发现DjAtg7基因表达水平在涡虫切割后再生的第3天显著升高,是对照水平的1.33倍。在涡虫再生的第5,7,10天都保持相对较高的表达水平。涡虫再生过程中DjAtg7基因的表达水平升高表明DjAtg7可能与涡虫的再生有关。原位杂交显示,在整体涡虫中DjAtg7基因主要在肠道组织中表达。切割再生的涡虫在再生第3天,第5天,第7天时在芽基部位出现强烈的杂交信号。但是在涡虫再生第10天时,强烈的杂交信号从芽基部位逐渐消失,出现在原有组织的肠道远端分支上,结果表明DjAtg7基因可能参与涡虫肠道组织的再生和体型重塑过程。通过DjAtg7和DjPk-1的双荧光原位杂交共定位进一步证实了DjAtg7基因主要在涡虫肠道组织表达且在新再生的肠分支中高度表达。荧光原位杂交显示DjAtg7并未与DjWi-1在涡虫再生的芽基部位发出共定位的信号,说明DjAtg7阳性细胞不是Neoblast细胞或Neoblast细胞早期后代。DjAtg7基因的表达模式表明该基因在涡虫再生的早期阶段可能参与涡虫肠道组织再生和重构。(3)RNAi-DjAtg7表型观察和自噬相关基因的检测:RNAi-DjAtg7涡虫切割后可以正常再生,与对照组涡虫相比没有明显差异,说明干扰DjAtg7对涡虫再生没有明显影响。干扰涡虫再生15天后可以正常摄食,说明干扰DjAtg7基因不影响涡虫肠道的再生,也不影响涡虫肠道系统的生理功能。qPCR检测显示,干扰后内源性DjAtg7基因表达水平极显著下降,原位杂交结果显示肠道组织无明显阳性杂交信号,说明干扰是有效的。进一步检测发现,与细胞自噬经典途径相关的DjAtg5、DjAtg8和DjAtg12的表达在干扰DjAtg7基因后没有明显的变化。而与细胞自噬替代途径相关的DjAtg1、DjPi3k和DjAtg6的表达水平在干扰DjAtg7后明显增加。特别是在干扰DjAtg7基因后涡虫DjRab9A的表达增加了3.3倍。从这些结果推测涡虫中可能存在DjAtg7非依赖性自噬途径。(4)涡虫体型重塑过程中亚显微结构观察:透射电子显微镜观察再生第7天和第10天的涡虫,发现在正常细胞中,细胞核保持圆形,细胞质中不存在自噬囊泡。在自噬的早期阶段,自噬囊泡开始出现在细胞质中。在自噬的中期阶段,大量的自噬囊泡在细胞质中积累并形成自噬体。在自噬的晚期阶段,细胞表现出自噬性细胞死亡的典型特征,除了细胞核以外,细胞质被消化吸收。在自噬的最后阶段,染色质高度浓缩并降解成片段结构,被多层膜包围。此外,还观察到大囊泡包含着小囊泡从细胞内部释放到细胞外。这种细胞质排空的现象与自噬性细胞死亡可以为其他细胞的存活提供营养物质的假设一致。通过观察涡虫表型发现DjAtg7基因干扰后并没有明显影响涡虫的再生情况,透射电子显微镜(TEM)观察发现干扰DjAtg7基因后不影响涡虫细胞内自噬体的形成。总结:(1)本文首次克隆和解析了日本三角涡虫DjAtg7基因的全长cDNA序列,其编码的蛋白质属于E1泛素化酶超家族成员;(2)qPCR和原位杂交显示DjAtg7可能参与涡虫肠支再生和组织重构;(3)TEM显示涡虫体型重塑过程中存在细胞自噬和自噬性细胞死亡现象。自噬和自噬性细胞死亡可能为涡虫再生提供了能量来源;(4)RNAi-DjAtg7不影响涡虫再生和涡虫细胞内自噬体的形成,说明细胞自噬是一个非常复杂的分子机制。