环糊精（CDs）是一类具有亲水性表面和疏水性空腔的环状低聚糖,能够包埋疏水性的分子或基团形成水溶性的包合物,这一特性使CDs广泛应用于化妆品、制药、食品、化学工业等领域。环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的环化反应能够催化淀粉类的底物生成环糊精,但是催化产物通常为α-、β-和γ-CD的混合物,后期需要通过分离纯化获得单一的环糊精产物,这大大提高了生产的成本。因此,通过对CGTase进行分子改造从而提高产物专一性是目前研究的一个热点。本研究基于对海洋环糊精葡萄糖基转移酶CGTase模拟结构和氨基酸序列分析,确定了可能对产物专一性有影响的氨基酸位点R81,利用定点突变技术,以重组表达质粒p ET24a-cgt为模板,成功将CGTase氨基酸序列第81位的精氨酸突变为苏氨酸,构建了突变体R81T并表达了突变酶。为了提高突变酶在大肠杆菌BL21（DE3）中的蛋白表达量,对诱导剂的浓度、诱导时间和诱导温度三个单因素进行了优化实验。实验结果表明最佳IPTG诱导浓度为0.4m M。IPTG浓度过低,诱导不充分,蛋白表达量低;IPTG浓度过高,可能对宿主菌有毒害作用或使蛋白表达过快生成无活性的包涵体。最适诱导温度为20℃,温度过低,菌体生长缓慢,蛋白表达受限;温度过高,蛋白翻译速度过快来不及折叠,也容易聚集生成包涵体。最佳诱导时间为15 h-18 h,培养时间过长会使菌体死亡破裂造成蛋白流失。最终确定的诱导表达条件为将种子液以2%的接种量接种到LB液体培养基中,37℃,200 r/min培养至OD₆₀₀在0.6左右,加入终浓度为0.4 m M的IPTG,在20℃,200 r/min的培养条件下诱导15 h。按上述优化后的诱导条件发酵4 L发酵液,超声破碎离心后制得400 m L粗酶液,采用两步层析法对粗酶液进行纯化,经过第一步镍柱亲和层析和超滤浓缩除盐,酶的比活力由0.065 U/mg提高至0.26 U/mg,纯化倍数为4.02。为了除去少量杂蛋白条带,通过凝胶过滤层析对蛋白进行进一步纯化,实现蛋白的电泳纯,超滤浓缩后得到22 mg/m L的蛋白溶液做为蛋白结晶原料。用蒸气扩散法进行蛋白结晶实验,初筛结晶条件为利用成分为0.2 M乙酸铵,0.1 M Tris p H8.5,45%V/V（+/-）-2-甲基-2,4-戊二醇的结晶试剂与蛋白样品以2:1,1:1的比例混合,在4℃放置6天。对初筛结晶条件进行优化,优化后的结晶条件为其他条件不变,提高结晶试剂中乙酸铵浓度至0.4 M。取适量突变酶和原始酶的环糊精以1%的淀粉溶液为底物进行反应,通过实时监测产物生成量并对产物进行高效液相分析,发现突变酶的α-CD产量与原始酶相比降低了8%,而β-CD的产量由原始的64%提高到71%,此外γ-CD的产量也有较明显的提高。上述结果验证了突变体R81T在改善产物专一性方面的猜想,原因可能是因为精氨酸突变为苏氨酸后,氨基酸侧链变短,增加了底物结合的空间,有利于生成体积较大的环糊精分子。此外还发现氨基酸突变前后,与周围氨基酸及底物的氢键作用力有明显改变。通过对比原始酶和突变酶在最适p H、最适反应温度、p H稳定性和温度稳定性方面的酶学性质,发现突变酶保留了原始酶耐热性、嗜碱性、热稳定性及p H稳定性。