创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是在当今生活中全球死亡和残疾的主要原因。也是一个全球范围内尚未解决的重大公共卫生课题。机械破坏神经元触发一连串的机体反应导致神经细胞死亡,脑水肿和神经功能缺损。然而,细胞死亡大体归类三种类型:坏死、凋亡和自噬。一些研究表明TBI发生后自噬被激活,LC-3和Becline-1的表达在损伤海马和皮层上调。其他研究表明抑制自噬具有减轻TBI和提高神经功能恢复。右美托咪定是拥有催眠、镇静、镇痛、抗焦虑药、交感神经阻滞功效而没有显著的对呼吸调控的产生。因此,右美托咪定广泛应用在手术室和重症监护室麻醉和镇静。目前,大量文献报道,右美托咪定可能对缺血性脑损伤具有神经保护的作用。右美托咪定也被报道减轻脑缺血以及再灌注时出现的动物脑破坏。文献指出,右美托咪定能提高抗凋亡因子BCL-2水平和ERK1/2磷酸化参与细胞生存,从而抑制凋亡和改善脑神经元生存。目前,PI3K/Akt/mTOR被广泛报道是细胞凋亡和自噬激活的经典信号通路。基于上述发现,我们假设应用右美托咪定可以激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制海马区神经元自噬,对TBI大鼠发挥强大神经保护作用。第一部分右美托咪定对大鼠脑创伤后神经功能恢复的影响目的:本部分实验研究采用雄性SD大鼠(270g-290g),制作非开放性大鼠脑创伤的损伤模型,并验证在大鼠脑创伤后右美托咪定对大鼠神经功能的恢复情况。方法:使用改装后的大鼠脑创伤模型制备仪器制作大鼠脑损伤模型。将大鼠随机分为三组(n=48):对照组(sham组),脑创伤组(TBI组),右美托咪定组(Dex组)。每组分别取脑创伤后的6 h,12 h,24 h,48 h进行检测,另取20只大鼠行水迷宫测试,每组划分为伤后6d、7d、8d及9d四个时间点。检测方法:1干湿比重法检测脑组织水含量;2水迷宫测试,检测空间学习能力;3神经运动功能评分;4矿场实验。在本实验中获取的实验数据结果使用Excel建立,用均值±标准差(sx±)体现,使用SPSS 16.0系统将所得数据随机的单因素方差分析,两组之间的比较使用qq检验的方式,用P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.脑创伤后的光镜观察在脑创伤后,可以看到整个蛛网膜下腔都有出血,同时也有少部分的脑室出血。在脑实质中以点状出血为主,通过观察,可以看到在大鼠的脑表层有明显的血管充血,并没有看到局部的脑创伤情况。2.检测脑组织水含量结果Sham组各时间点脑组织水含量未见差异;TBI组均明显高于Sham组(P<0.05);Dex组各时间点水含量较TBI组明显减少(P<0.05),提示TBI后的脑组织出现明显脑水肿。3.水迷宫检测结果设置的实验时间在各每组创伤后的第6、7、8以及9天进行Morris水迷宫检测。实验结果显示,TBI组在伤后第8天和第9天搜索安全岛潜伏期明显的要比sham组时间增加,差异有统计学意义(P<0.05)。Dex组在伤后第8天以及第9天搜索安全岛潜伏期要比sham组有显著的缩短,说明大鼠的记功能得到了一定的恢复,差异有统计学意义(P<0.05)。4.神经功能评分结果Sham组评分为24分,TBI组评分在7-9分之间,Dex组评分15-18分之间。和sham组比,TBI组中,大鼠在后肢抓持反射、触须诱发前肢定位以及侧向垫步的测试中都有不正常的表现,导致功能评分降低,具有统计学意义(P<0.05);Dex组和TBI组比,各项的功能评分有显著的升高,这也就是说明大鼠的运动功能得到了一定改善(P<0.05)。5.矿场试验Sham组大鼠的行走的总路程、中央格活动的时间、直立的次数和修饰行为次数最少,TBI组大鼠行走的总路程、中央格活动的时间、直立的次数和修饰行为次数少于对照组(P<0.05);Dex组和TBI组比,总路程、中央格活动的时间、直立的次数和修饰行为次数有所下降,但高于sham组(P<0.05)。小结:大鼠脑损伤模型达到了实验的基本要求;通过对行为学相关实验的检测,数据显示在大鼠脑创伤后右美托咪定能够在一定程度上对神经功能起到恢复的作用。第二部分右美托咪定对大鼠脑创伤后神经元自噬的影响目的:本部分实验所研究的内容是右美托咪定能否对大鼠脑创伤后神经元中的自噬情况产生影响。方法:使用改装后的大鼠脑创伤模型制备仪器制作大鼠脑损伤模型。将大鼠随机分为四组(n=48):对照组(sham组);脑创伤组(TBI组);3-MA自噬抑制剂组(3-MA组);右美托咪定组(Dex组)。取创伤后6h、12h、24h、48h四个时间点。检测方法:(1)HE染色;(2)免疫组织化学法染色检测LC-3和Beclin-1蛋白表达情况;(3)Western-blot法检测自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1表达情况。免疫化学染色检测结果采用Image Proplus6.0分析系统定量分析测定。免疫印迹检测结果使用Image J图像分析处理软件对蛋白所反应的条带进行半定量分析,得到光密度值(OD值),用目的蛋白的OD值和内参(β-actin)OD值的比值相比,做为基础对照进行对比。本实验中得到的所有实验数据结果使用Excel建立,用均值±标准差(sx±)体现,使用SPSS 16.0系统将所得数据随机的单因素方差分析,两组之间的比较使用qq检验的方式,用P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.脑创伤后的光镜观察脑创伤后可以看到蛛网膜下腔存在着大量的出血,并且还伴随着部分脑室性质的出血。在脑实质中以点状出血为主,通过观察,可以看到在大鼠的脑表层有明显的血管充血,并没有看到局部的脑创伤情况。2.HE检测结果观察HE染色结果显示,在sham组中脑的组织结构没有发生变化,血管的管壁整齐,神经细胞形态规则;TBI组神经元细胞胞体发生了形状上的改变,胞浆染色降低,细胞核出现深度染色,能够看到在细胞之间出现了明显的间隙,并且伴有坏死的神经元细胞出现。Dex组和3-MA组相比较TBI组神经元细胞的结构以及染色深度都有所改善。3.Beclin-1的免疫组化检测结果Beclin-1出现棕色或黄色染色视为阳性表达,在sham组中能够看到微弱的Beclin-1的阳性表达。同sham组比,TBI组Beclin-1的阳性细胞数显著增多,免疫反应性增强。并且在创伤后6 h表达趋势逐渐增强,到达24小时到达最高,48小时出现回落。相比于TBI组,Dex组和3-MA组的各时间点的表达趋势没有发生变化,表达的高峰仍然在24 h,但是整体表达明显减弱。4.LC-3的免疫组化检测结果LC-3出现棕色或黄色染色视为阳性表达,在sham组中能够看到微弱的LC-3的阳性表达。同sham相比,TBI组LC-3的阳性细胞数显著增多,免疫反应性增强。并且在创伤后6 h表达趋势逐渐增强,到达24小时到达最高,48小时出现回落。相比于TBI组,Dex组和3-MA组的各时间点的表达趋势没有发生变化,表达的高峰仍然在24小时,但是整体表达明显减弱。5.Beclin-1的Western blot检测结果Beclin-1的分子量为60KD,sham组Beclin-1蛋白有微量基础表达,并且每个时间点的表达均无明显变化趋势。同sham组相比较,TBI组Beclin-1蛋白在各时间点都出现了表达的显著增升高(P<0.05),且表达呈现动态变化趋势,从6 h时即出现增高,持续到24h达到增长峰值,48h时表达逐渐回落,但是仍然高于同时间sham组的基础表达。与TBI相比,Dex组和3-MA组Beclin-1蛋白在各时间点的表达都有明显下降(P<0.05),但趋势未发生变化,蛋白表达高峰依然位于24 h。6.LC-3的Western blot检测结果LC-3的western blot检测结果显示出深浅不同的双条带LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ,LC-3Ⅰ的分子量为15KD,LC-3Ⅱ的分子量为17KD。Sham组LC-3Ⅱ蛋白有微量基础表达,并且每个时间点的表达均没有明显变化趋势。同sham相比,TBI组LC-3Ⅱ蛋白在各时间点都出现了显著升高(P<0.05),且表达呈现动态变化趋势,从6小时时即出现增高,持续到24小时为增长峰值,48小时时表达水平逐渐回落,依然高于sham组的同时间的基础表达。与TBI组相比,Dex组和3-MA组LC-3蛋白在每各时间点的表达都有显著下降(P<0.05),趋势没有发生改变,峰值依然位于24小时。小结:通过自噬抑制剂组对自噬相关蛋白的检测,证实了在大鼠脑损伤后有自噬的存在;药物组进一步证实了,右美托咪定能够降低自噬相关蛋白的表达,进而达到神经保护。第三部分右美托咪定激活PI3K/Akt/mTOR通路对大鼠脑创伤后神经元自噬的影响目的:本部分实验所研究的内容是右美托咪定是否通过激活PI3K/Akt/mTOR通路对大鼠脑创伤后神经元中的自噬情况产生影响。方法:使用改装后的大鼠脑创伤模型制备仪器制作大鼠脑损伤模型。将大鼠随机分为三组(n=48):正常对照组(sham组);脑创伤组(TBI组);右美托咪定组(Dex组)。取创伤后6h、12h、24h、48h 4个时间点。检测方法:(1) HE染色;(2) Western-blot法检测p-AKt和p-mTOR蛋白的定量情况;(3)荧光双标检测LC-3和NeuN共定位表达。分析和统计同第二部分。结果:1.脑创伤后的光镜观察脑创伤后可以看到蛛网膜下腔存在着大量的出血,并且还伴随着部分脑室性质的出血。在脑实质中以点状出血为主,通过观察,可以看到在大鼠的脑表层有明显的血管充血,并没有看到局部的脑创伤情况。2.HE检测结果观察HE染色结果显示,在sham组中脑的组织结构没有发生改变,血管的管腔中没有发现异常,血管的管壁平整,神经细胞形态规则;TBI组神经元细胞胞体出现形状的改变,胞浆染色降低,细胞核出现深度染色,能够看到在细胞之间出现了明显的间隙,并且伴有坏死的神经元细胞出现。Dex组相比较TBI组神经元细胞的结构以及染色深度都有所改善。3.p-AKt的Western blot检测结果sham组中的个时间点的p-AKt蛋白表达都很均一,并且每个时间点的表达均无明显变化趋势。同sham组相比较,TBI组p-AKt蛋白在从12h开始出现了表达的显著增升高(P<0.05),且表达呈现动态变化趋势。与TBI组相比较,Dex的蛋白表达都有所上升,但是表达趋势没有变化(P<0.05)。4.p-mTOR的western blot检测结果sham组中的个时间点的p-mTOR蛋白表达都很均一,并且每个时间点的表达均无明显变化趋势。同sham组相比较,TBI组p-mTOR蛋白在从12 h开始出现了表达的显著增升高(P<0.05),且表达呈现动态变化趋势。与TBI组相比较,Dex的蛋白表达都有所上升,但是表达趋势没有变化(P<0.05)。5.LC-3和NeuN共定位结果24小时后观察TBI组LC-3和NeuN共定位的双重免疫荧光染色,LC-3为DyLight 594标记的细胞胞浆红色荧光,神经元特异性标记物NeuN为DyLight 488标记的细胞胞浆绿色荧光。在TBI组的海马区中,我们可以看到有大量的红色和绿色荧光的重叠,呈现为橙色,表明自噬位于神经元。在24小时Dex组时,红色荧光显着较弱,并且红色和绿色荧光的重叠显着降低,说明海马区域中神经元自噬的水平降低。小结:已经证实在大鼠脑创伤后,存在着神经元的自噬,本部分实验进一步证实了,右美托咪定能够通过激活PI3K/Akt/mTOR通路相关因子从而降低自噬相关蛋白的表达,进而达到神经保护,以及缓解脑创伤后对大鼠学习和记忆功能的改善。结论:在大鼠弥漫性脑创伤中,存在着自噬情况的发生,右美托咪定能够激活PI3K/Akt/mTOR通路,并参与到了对自噬的调控中;右美托咪定能够降低自噬的表达,对脑创伤后神经功能的恢复起到积极促进的作用,达到神经保护的作用。