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目的:1.建立罗非鱼肝细胞的分离及纯化方法。2.应用微囊化法对罗非鱼肝细胞进行免疫隔离。3.观察微囊化罗非鱼肝细胞移植对肝衰大鼠的治疗作用。4.探讨鱼纲与哺乳纲动物间肝细胞移植的可能性。材料和方法:1.采用胶原酶冷消化法和两步低速离心法分离罗非鱼肝细胞。应用倒置显微镜和透射电镜观察罗非鱼肝细胞形态及其超微结构。采用台盼蓝拒染法检测细胞活力。2.D-GalN(D-galactosamine,D-氨基酸半乳糖盐酸盐)大鼠腹腔内注射,建立急性药物性肝衰模型。3.采用ACA(Alginate-Chitosan-Alginate,海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠)微囊包裹罗非鱼肝细胞移植入肝衰大鼠模型腹腔内,即微囊化罗非鱼肝细胞移植组(简称微囊化组,N=35只);并设立空微囊移植组(空微囊组,N=28只)、裸肝细胞移植组(裸肝细胞组,N=35只)及NS(Normal saline,生理盐水)对照组(NS组,N=28只)等作为实验对照。4.比较移植后各组肝衰大鼠的一周存活率;于移植后24h和48h分别取各组存活大鼠5只经腹主动脉取血作肝功能检测,观察谷丙转氨酶、总胆红素和白蛋白的变化;分别在24h、48h、7d和14d时间点上对移植物进行光镜和电镜的病理检查。结果:1.平均每条鱼获得0.93±0.22×10~8个肝细胞,台盼蓝染色示肝细胞活率为90.1±0.79%,纯度为89.75±1.92%。光镜下新分离的肝细胞呈透亮圆球形,形态大小一致,少数聚集成团。透射电镜示罗非鱼肝细胞细胞质内可见大量圆形或卵圆形线粒体和糖原颗粒;粗面及滑面内质网较多;细胞核形状较为规则,大而圆,核仁清晰。2.制备好的空微囊多为圆形,边缘清晰,内部为透明凝胶液体,外部膜结构完整。包裹肝细胞大部分居于微囊内部,仅有少量肝细胞贴于囊壁上。3.移植后受体一周存活率比较:微囊化组受体一周存活率为57.9%明显高于裸肝细胞组(21.1%,P<0.05);与空微囊组(16.7%)、生理盐水组(16.7%)比较亦有显著性差异(P<0.05);而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显著(P>0.05)。4.移植48h后受体肝功能检测:(1)微囊化肝细胞组ALT为1103.9±132.4U/L,明显低于裸肝细胞组(2188.3±185.4U/L,P<0.01);与空微囊组(2257.8±283.3U/L)、生理盐水组(2379.2±168.7U/L)比较亦有显著性差异(P<0.01);而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显著(P>0.05)。(2)微囊化肝细胞组TBIL为6.21±0.86μmol/L,明显低于裸肝细胞组(9.18±0.96μmol/L,P<0.05);与空微囊组(8.82±0.93μmol/L)、生理盐水组(8.76±0.74μmol/L)比较亦有显著性差异(P<0.05);而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显著(P>0.05)。(3)微囊化肝细胞组ALB为23.2±1.14g/L,明显低于裸肝细胞组(21.0±1.98g/L,P<0.05);与空微囊组(20.6±1.34g/L)、生理盐水组(19.3±1.22g/L)比较亦有显著性差异(P<0.05);而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显著(P>0.05)。5.各组移植物病理检查:裸肝细胞在移植后48h即可见腹腔内有较多白色团块粘附于大网膜上,收集移植物组织HE染色后光镜检查可见腹膜将移植的裸肝细胞包裹为细胞团块,周围大量炎症细胞浸润,肝细胞多已变性坏死;而微囊化组在移植后48h,可从受体腹腔中收集到形态完整的微囊,其内肝细胞活力良好,台盼蓝染色示肝细胞活率可达到80%。移植后7d,微囊化组受体腹腔内可见到形态完整、无明显粘连的微囊。其内肝细胞存活良好,将微囊压碎后,肝细胞台盼蓝染色活力达45.3±5.8%。透射电镜观察可见微囊内罗非鱼肝细胞结构正常,细胞核形状较为规则。移植后14天大体观察见含罗非鱼肝细胞的微囊主要粘附于肠壁、网膜、肝脏下缘和侧腹壁,少量微囊粘聚成团,周围可见血管形成。将微囊压碎后,肝细胞台盼蓝染色活力仍可达34.7±4.0%。结论:1.胶原酶冷消化法分离的罗非鱼肝细胞形态完整、活性良好,产量和纯度均较高,是一种较好的分离方法。2.移植后罗非鱼肝细胞能在微囊内较长期存活,具有较强的耐低氧能力。3.ACA微囊可起到良好的免疫隔离作用,有利于移植物的长期存活,并且其具有较好的生物相容性,较为有效的避免了囊周纤维化的发生。4.微囊化包裹罗非鱼肝细胞腹腔内移植有助于大鼠急性药物性肝衰的逆转,显著提高急性肝衰大鼠的存活率、改善肝功能、减轻肝脏病理改变。