肝脏是人体的重要器官,具有代谢、分泌、排泄、解毒等生理功能。很多因素可导致肝脏损伤,最常见的因素是病毒感染,近年来随着人们的社交越来越频繁,酒精性肝损伤有上升的趋势,此外药物性肝损伤如非甾体类抗炎药引起的肝损伤也较为常见。目前临床上治疗急性肝损伤首先要控制诱因或病因,然后再进行保肝降酶、抗病毒等治疗,常用的药物有甘草酸胺类、还原型谷胱甘肽、糖皮质激素等,但其毒副作用较大,其中甘草酸胺类可以引起假性醛固酮症、电解质改变等;还原型谷胱甘肽可以引起消化道症状及皮疹等。因此,寻找高效、低毒、应用范围广的治疗药物和方法成为目前研究的热点。黄芩苷具有清除自由基,抗氧化及抗炎等药理活性,临床上黄芩苷片、黄芩苷胶囊主要用于治疗肝炎、急性胆道感染等疾病,但黄芩苷水溶性差,限制了其临床应用。黄芩苷镁盐是黄芩苷在黄芩中的原本存在形式,其水溶性及稳定性极好。承德医学院中药研究所刘翠哲教授课题组掌握了从黄芩中提取黄芩苷镁及将市售黄芩苷制备成黄芩苷镁盐的工艺,并且已经授权国家发明专利。我国黄芩资源丰富,如果能建立稳定的且与临床急性肝损伤发病情况类似的动物模型,探讨黄芩苷镁对其保护作用,将为急性肝损伤发病机制的研究及黄芩苷镁的推广应用提供实验依据。目的:探讨黄芩苷镁预处理对脂多糖(LPS)联合D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的急性肝损伤的保护作用及机制,为黄芩苷镁的开发及临床应用提供实验依据。方法:1确定LPS和D-GalN造模的最佳剂量与取材时间1.1确定实验方案考虑各因素一阶交互作用,使用SPSS软件对LPS(A因素)3个水平为 20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg,D-GalN(B 因素)3 个水平为 200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg,取材时间(C因素)3个水平为3小时、6小时、12小时按L9(34)正交表设计实验。组合后分为9组,分别是A2B3C1组、A3B2C1 组、A1B1C1 组、A3B3C2 组、A2B1C2 组、A1B2C2 组、A3B1C3组、A1B3C3组、A2B2C3组,另设正常组做对照。雄性SD大鼠适应性饲养7天,按体重以随机区组法进行分组,每组10只。禁食不禁水12小时后,模型组按体重给予相应的LPS和D-GalN溶液(现配现用)进行腹腔注射,正常组给予等体积生理盐水。造模后正常饮食、自由饮水,观察各组大鼠的一般情况。1.2 指标的检测造模后在各对应的时间取材,计算肝脏指数;用全自动分析生化仪检测各组血清ALT、AST含量;HE染色观察肝组织病理变化,确定最佳造模条件。2黄芩苷镁预处理对LPS/D-GalN致大鼠急性肝损伤的保护作用2.1 实验分组及处理大鼠适应性饲养7天,随机分为7组,每组9只,分别为正常对照组、模型组、异甘草酸镁(MgIG)组(18mg/kg)、黄芩苷镁(BA-Mg)高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)剂量组、黄芩苷组(与黄芩苷镁中剂量组所含的黄芩苷摩尔数相等)。正常组与模型组尾静脉给予等体积生理盐水,其他药物组尾静脉注射给予相应的药物1天1次连续7天。除正常组外均以确定的最佳造模剂量即20 μg/kg LPS联合400 mg/kg D-GalN腹腔注射制备急性肝损伤模型,观察整个实验过程中大鼠的一般情况,于造模后12小时取材。以HE染色发生病理性改变及转氨酶AST和ALT高于正常组,判断造模成功。2.2 实验指标检测称量大鼠的体重及肝脏的重量计算肝脏指数;比色法检测血清中ALT、AST的含量;HE染色观察肝组织病理学变化;TBA比色法检测血清及肝组织中MDA的含量;嘌呤氧化酶法检测血清和肝组织中SOD的含量;ELISA 法检测血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ含量;RT-PCR 法检测IL-6、TNF-αmRNA 表达情况。2.3 统计学分析方法用SPSS19.0统计软件分析,a=0.05为检验水准。确定最佳造模条件各实验组血清中ALT、AST含量用正交实验直观分析法;其他计量资料组间比较用单因素方差分析LSD或Games-Howell检验,结果用x±S表示。结果:1确定LPS和D-GalN造模的最佳剂量与取材时间1.1各组大鼠的一般情况实验过程,正常组大鼠精神状态好,A1B3C3、A2B2C3两组SD大鼠造模后精神萎靡,活动减少,其他各组精神状态尚可。1.2 肝指数各模型组与正常组比肝指数差别无统计学意义(P>0.05)。A1B3C3组肝指数的平均值最大。1.3 各组肝组织病理变化HE染色显示,正常组肝小叶的结构规则,肝细胞成条索状并以中央静脉为中心,向四周放射排列,肝细胞无坏死及炎细胞浸润等情况。A1B3C3组肝小叶被破坏,肝细胞排列紊乱,肝血窦内充满大量红细胞,肝细胞成弥漫性点、灶状坏死,肝细胞核消失,坏死灶内有大量炎细胞浸润,提示模型制备成功,其他模型组肝细胞坏死及炎细胞浸润较轻。1.4 血清转氨酶变化分析结果各模型组血清ALT、AST含量较正常组升高,提示模型制备成功。通过正交实验直观分析法得出ALT极差为RA(1299.79)>RB(1215.81)>RC(1112.03),AST 的极差为 RA(2250.57)>RB(2094.58)>RC(1861.20),即A因素对转氨酶结果的影响最大,C因素对转氨酶的结果影响最小。ALT和AST的均值均为A因素1水平的均值最大,B因素3水平的均值最大,C因素3水平的均值最大,分别为1470.44、1453.54、1308.04;2582.85、2555.85、2285.6。以大鼠血清转氨酶ALT、AST的含量为主要参考指标,结合大鼠的一般状况、肝组织病理检查结果、肝指数,确定LPS 20μg/kg、D-GalN400mg/kg、造模后12小时取材,即A1B3C3组为最佳组合。2 黄芩苷镁对LPS/D-GalN致大鼠急性肝损伤的保护作用2.1 大鼠的一般情况整个实验过程中各组大鼠的体重均有所增加。给药大约3天,黄芩苷镁各组、黄芩苷组大鼠尿液发黄,其他组无异常。造模后模型组和各药物组大鼠精神萎靡、反应迟缓、运动减少、食欲降低,尤以模型组大鼠明显。2.2 各实验组肝指数结果与正常组比,模型组肝指数增大,差别有统计学意义(P<0.05)。与模型组比,各药物组肝指数均减小,差别有统计学意义(P<0.05)。黄芩苷镁各组与异甘草酸镁组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。2.3 各实验组血清ALT、AST的变化与正常组相比,模型组血清中ALT的含量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,异甘草酸镁组、黄芩苷镁各剂量组血清ALT含量均明显降低(P<0.05),黄芩苷组ALT含量与模型组无差别(P>0.05)。与异甘草酸镁组比较,黄芩苷镁高、中剂量组血清中ALT含量低于异甘草酸镁组(P<0.05),而低剂量组ALT含量高于异甘草酸镁组(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组血清中ALT含量与黄芩苷组比较,差别均无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比,模型组血清中AST的含量升高(P<0.05)。与模型组相比,异甘草酸镁组、黄芩苷镁高、中剂量组血清AST的含量降低(P<0.05),低剂量组与模型组无差别(P>0.05),黄芩苷组血清AST含量与模型组比较差别无统计学意义(P>0.05)。与异苷草酸镁组比较,黄芩苷镁高、低剂量组血清AST含量高于异甘草酸镁组(P<0.05),中剂量组血清AST含量与异甘草酸镁组比较有升高的趋势,但差别无统计学意义(P>0.05)。黄芩苷镁各剂量组血清中AST含量与黄芩苷组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。2.4 各组HE染色肝组织病理学正常组肝小叶的结构规则,肝细胞着色均匀、呈条索状排列并以中央静脉为中心,向四周放射排列,肝血窦无挤压、断裂,肝细胞无坏死及炎细胞浸润等情况;模型组肝小叶结构被破坏,肝细胞条索排列紊乱,肝血窦变宽,肝细胞核碎裂,细胞核正常形态消失,整个视野可见肝细胞呈弥漫性多发性点、灶状坏死,坏死灶内有大量炎细胞浸润,以中性粒细胞为主,增宽的肝血窦内充满红细胞;黄芩苷镁组肝细胞损伤程度较模型组轻,肝小叶结构被破坏,肝细胞索排列紊乱,可见部分视野有点、灶状坏死区。肝血窦增宽,其中低剂量组增宽的肝血窦将肝细胞分成小片状。肝细胞质着色不均匀,其中黄芩苷镁低剂量组可见较多的肝细胞发生嗜酸性变;异甘草酸镁组除有少量的炎细胞浸润外,肝细胞形态结构与正常组差别不明显;黄芩苷组肝小叶结构基本完整,肝细胞索排列相对有序,部分肝细胞形态被破坏,有点状、小片状坏死灶,坏死灶内有炎细胞浸润。2.5 各组氧化指标MDA、SOD的变化2.5.1 MDA 结果模型组血清中MDA含量较正常组升高,差别具有统计学意义(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组、异甘草酸镁组、黄芩苷组血清中的MDA含量较模型组显著降低(P<0.05)。异甘草酸镁组血清中MDA含量与黄芩苷镁高剂量组无明显差别(P>0.05),但低于黄芩苷镁中、低剂量组(P<0.05)。黄芩苷镁高剂量组血清中MDA含量与黄芩苷组比较,差别无统计学意义(P>0.05),黄芩苷镁中、低剂量组血清中MDA含量高于黄芩苷组(P<0.05)。模型组肝组织匀浆中MDA含量较正常组升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较黄芩苷镁高剂量组、异甘草酸镁组肝组织匀浆中MDA含量明显降低(P<0.05),黄芩苷镁中、低剂量组及黄芩苷组肝组织匀浆MDA含量与模型组无差别(P>0.05)。黄芩苷镁高、中剂量组肝组织匀浆中MDA含量与异甘草酸镁组无差别(P>0.05),低剂量组高于异甘草酸镁组(P<0.05)。黄芩苷镁高剂量组肝组织匀浆中MDA含量低于黄芩苷组(P<0.05),而中、低剂量组与黄芩苷组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。2.5.2 SOD 结果与正常组比模型组血清SOD含量明显降低(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组、异甘草酸镁组、黄芩苷组血清SOD含量较模型组明显升高(P<0.05)。黄芩苷镁高、中剂量组血清SOD含量与异甘草酸镁组比较无差别(P>0.05),低剂量组血清SOD含量低于异甘草酸镁组(P<0.05)。与黄芩苷组比较,黄芩苷镁高剂量组血清SOD含量高于黄芩苷组(P<0.05),中剂量组血清SOD含量与黄芩苷组无差别(P>0.05),低剂量组血清SOD含量低于黄芩苷组(P<0.05)。与正常组比较,模型组肝组织匀浆中SOD的含量显著降低(P<0.05)。与模型组比较黄芩苷镁高剂量组、异甘草酸镁组肝组织匀浆中SOD含量明显升高(P<0.05),黄芩苷镁中、低剂量组及黄芩苷组与模型组无差别(P>0.05)。黄芩苷镁中剂量组肝组织匀浆中SOD含量低于异甘草酸镁组(P<0.05),高、低剂量组与异甘草酸镁组无差别(P>0.05)。黄芩苷镁高剂量组肝组织匀浆中SOD的含量高于黄芩苷组(P<0.05),而中、低剂量组与黄芩苷组比较无差别(P>0.05)。2.6 ELISA检测各组血清细胞因子含量的变化情况2.6.1 血清中IL-6含量的变化模型组血清中IL-6的含量较正常组升高,差别具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较黄芩苷镁高、中剂量组、异甘草酸镁组、黄芩苷组血清中IL-6含量明显降低(P<0.05),而黄芩苷镁低剂量组与模型组无差别(P>0.05)。黄芩苷镁中、低剂量组血清IL-6含量高于异甘草酸镁组(P<0.05),而黄芩苷镁高剂量组与异甘草酸镁组无差别(P>0.05)。黄芩苷镁高剂量组血清IL-6含量低于黄芩苷组(P<0.05),中、低剂量组与黄芩苷组无差别(P>0.05)。2.6.2 血清中IL-1β含量的变化模型组血清中细胞因子IL-1β的含量较正常组升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比除了黄芩苷镁低剂量组无差别外(P>0.05),黄芩苷镁高、中剂量组,异甘草酸镁组、黄芩苷组血清IL-1β含量均明显降低(P<0.05)。黄芩苷镁中、低剂量组血清IL-1β含量高于异甘草酸镁组(P<0.05),黄芩苷镁高剂量组血清IL-1β含量与异甘草酸镁组无差别(P>0.05)。黄芩苷镁高、中剂量组血清IL-1β含量低于黄芩苷组(P<0.05),低剂量组与黄芩苷组比较无差别(P>0.05)。2.6.3 血清中TNF-α含量的变化模型组血清中TNF-α的含量明显高于正常组(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组、异甘草酸镁组、黄芩苷组血清TNF-α含量与模型组比较有降低趋势,但差别无统计学意义(P>0.05)。黄芩苷镁各剂量组血清中TNF-α含量分别与异甘草酸镁组和黄芩苷组比较,差别均无统计学意义(P>0.05)。2.6.4 血清中IFN-γ含量的变化模型组血清中IFN-γ的含量明显高于正常组(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组、异甘草酸镁组、黄芩苷组血清IFN-γ含量较模型组均明显降低(P<0.05)。黄芩苷镁中、低剂量组血清IFN-丫的含量均高于异甘草酸镁组(P<0.05),而高剂量组与异甘草酸镁组比无差别(P>0.05)。黄芩苷镁中、低剂量组血清IFN-丫的含量高于黄芩苷组(P<0.05),高剂量组与黄芩苷组比无差别(P>0.05)。2.7 RT-PCR检测各实验组细胞因子mRNA表达量2.7.1 TNF-α的PCR检测结果与正常组比,模型组TNF-α mRNA表达明显升高(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组、黄芩苷组TNF-α mRNA表达与模型组比较无差别(P>0.05)。异甘草酸镁组与模型组比TNF-α mRNA表达明显降低(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组TNF-α mRNA表达量高于异甘草酸镁组(P<0.05)。黄芩苷镁各组TNF-α mRNA表达量与黄芩苷组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。2.7.2 IL-6的PCR检测结果与正常组比较,模型组肝组织IL-6 mRNA表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较黄芩苷镁各剂量组、异甘草酸镁组、黄芩苷组IL-6 mRNA表达量均有明显下降(P<0.05)。与异甘草酸镁组比较,黄芩苷镁各剂量组IL-6 mRNA表达量有升高的趋势,其中黄芩苷镁低剂量组与异甘草酸镁组比较,差别具有统计学意义(P<0.05)。黄芩苷镁各剂量组与黄芩苷组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。结论:1.20μg/kg LPS联合400 mg/kg D-GalN腹腔注射于造模后12小时取材为诱导大鼠急性肝损伤的最佳造模条件组合。2.黄芩苷镁预处理对于LPS联合D-GalN诱导的急性肝损伤具有保护作用,其作用可能与调控炎性细胞因子产生和抗氧化应激有关。