论文部分内容阅读
前言严重感染是儿科危重症中胃肠功能障碍的常见病因之一,其发病机制与内毒素血症和肠屏障功能破坏密切相关。内毒素系革兰氏阴性杆菌细胞壁成份,其主要生物活性成份为脂多糖(lipopolysacchcride,LPS)。胃肠功能障碍在危重症中的重要性越来越受到重视,被认为是多脏器功能障碍的始发因素之一。小儿胃肠功能障碍和衰竭,常提示病情加重和预后不良。机体在受到革兰氏阴性细菌的感染时,LPS作用于细胞膜受体,通过细胞内信号传递级联使基因表达发生变化,导致宿主细胞因子失控性表达,细胞发生代谢、形态等的变化,介导细胞损伤的发生发展。因此LPS介导的信号转导机制已成为一个广泛注意的研究领域,近年来已取得了不少进展。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者,目前已确定出四条MAPK信号转导通路,即细胞外信号调节激酶(extra cellular signal regulated proteinkinase,ERK)通路、C-Jun氨基未端激酶(C-Jun amino terminal kinase,JNK)通路、P38通路和ERK5通路。JNK信号转导通路是LPS信号转导通路中的一条重要通路,c-jun是JNK下游的直接作用底物。除了被生长因子激活外,JNK通路还能被LPS、TNF-α、L-1、紫外线、射线、热休克、细胞外高渗及DNA变性剂等激活。JNK通路的激活与多种系统的促凋亡作用有关。有研究报道,枯否细胞中JNK是LPS信号转导途径中的重要信号分子;JNK的激活可能参与了脑缺血所致神经元的损伤及脑低氧预适应的发生和发展;在IL-10基因缺失鼠小肠缺血再灌注损伤模型中,也发现了JNK/C-Jun信号转导通路的异常激活。但有关严重感染致胃肠粘膜损伤时JNK/c-Jun通路的变化国内外研究报道还很少。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-Kinase,PI3K)是生长因子超家族信号转导过程中的重要分子,Akt是原癌基因c-akt的表达编码的丝/苏氨基酸激酶,是PI3K直接的靶蛋白。PI3K主要通过生长因子与受体结合而激活,具有抗凋亡及促进细胞增殖分化的作用,与多种生物学事件有关,如囊泡运输、细胞骨架重建、细胞存活、肿瘤发生、细胞凋亡等。PI3K信号转导通路作为细胞的主要存活通路,对肠上皮细胞的存活、增殖和重建十分重要。有研究表明,PI3K是激活NF-κB的上游途径,而NF-κB信号转导通路是LPS所介导的信号转导通路中最重要的下游通路,活化的NF-κB可诱导众多炎症相关的特异基因如TNF,L-6,L-8等的表达。但有关LPS与PI3K/AKT信号转导通路的研究很少,国内尚未见报道。谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是血液循环和组织内游离氨基酸池中含量最丰富的一种氨基酸。肠粘膜和其它迅速增生的细胞的主要能量来源是Gln而非葡萄糖。许多动物实验及临床研究表明,Gln可以从维持肠粘膜屏障、对肠免疫功能的调节以及对肠道氧化损伤的保护作用等三个方面起到对肠屏障功能的保护作用。适当剂量Gln的肠外营养和肠内营养,可以增加肠绒毛高度及粘膜表面积和隐窝深度,增加隐窝细胞的有丝分裂,加快肠上皮细胞的更新速度,增强修复能力,并能促进肠道粘液素的合成,增强肠粘膜细胞间的紧密连接,减少上皮细胞的凋亡,阻止肠粘膜萎缩及炎症所致的通透性增加。目前,对Gln能改善各种病理状态的肠粘膜生长修复作用已给予充分的肯定,尤其在烧(创)伤、感染、手术后、放化疗肿瘤病人已取得一定效果。但其作用机制尚不完全清楚。总之,LPS通过作用于细胞膜受体,激活多条细胞内信号转导系统,形成一个错综复杂的信号转导网络,最终导致内毒素性休克,全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭等疾病的发生。尤其在小儿,因其自身的免疫功能以及肠道的屏障功能不全,严重感染所致的胃肠功能障碍,常是诱发其它器官功能障碍的原因,治疗有一定的难度,一旦到晚期病死率极高,而小儿胃肠功能障碍的发病机理还不完全清楚,本研究对内毒素血症及谷氨酰胺治疗后小肠粘膜JNK/c-Jun及PI3K/Akt信号转导通路进行研究,旨在探讨LPS引起小肠粘膜损伤及谷氨酰胺对其保护作用的有关细胞信号转导机制,以探索有效的预防和治疗途径。实验材料与方法1、材料用腹腔注射内毒素(4mg/kg大肠杆菌脂多糖O55:B5)方法制备18日龄大白鼠内毒素血症模型。不加任何处理因素为正常对照组,该组8只鼠。腹腔注射生理盐水为假注射对照组,腹腔注射内毒素为内毒素组,腹腔注射内毒素同时腹腔注射谷氨酰胺(2g/kg)为谷氨酰胺治疗组,每组40只鼠,分别于实验开始后2、4、6、24及72h各取8只鼠末段回肠4cm,分别放入10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋切片;2.5%戊二醛中保存,行电镜检测;液氮中速冻,储存于-76冰箱,行蛋白及核酸检测。2、方法光镜和透射电镜下观察小肠粘膜病理改变,免疫组化法检测小肠粘膜增殖细胞核抗原(PCNA)表达,原位末端标记(TUNEL)法检测小肠上皮细胞的凋亡,RT-PCR法检测JNK、c-Jun、PI3K及AKT mRNA的表达,Western Blot印迹分析检测PI3K总蛋白和JNK、c-Jun及AKT磷酸化蛋白的表达。采用SPSS10.0软件包进行统计学处理。实验结果1、小肠形态学改变光镜下小肠无明显病理改变,电镜下内毒素组出现不同程度各种凋亡形态学改变,谷氨酰胺组相应各时间点病变程度有所减轻。2、小肠上皮细胞的增殖及凋亡对照组小肠上皮PCNA阳性细胞很多,内毒素组PCNA表达强度明显低于对照组(P＜0.01),2h表达强度即明显降低,4h-6h达到最低值,72h仍未恢复正常水平。谷氨酰胺组PCNA表达明显高于内毒素组(P＜0.01),但低于对照组(P＜0.01)。与内毒素组比较,2h、4h和24h时间点升高显著。对照组凋亡细胞很少,内毒素组凋亡指数明显高于对照组(P＜0.01),2h凋亡指数即明显升高,24h达到高峰,72h仍未恢复正常。谷氨酰胺组凋亡指数虽较对照组高(P＜0.01),但各时间点均较内毒素组下降(P=0.01)。谷氨酰胺组凋亡指数随时间而增加,72h尚未出现回落趋势。3、小肠JNK、c-Jun mRNA和蛋白表达分析内毒素组JNK mRNA表达较对照组明显增强(P＜0.01),2h开始明显升高,6h达到高峰,72h尚未恢复正常。c-Jun mRNA的表达趋势与JNK mRNA的表达相同。谷氨酰胺组JNK及c-Jun mRNA表达较内毒素组有下降趋势,但均无统计学意义。内毒素组p-JNK蛋白表达较对照组明显升高(P＜0.01),2h即开始升高,4-6达到高峰,72h尚未恢复正常。谷氨酰胺组p-JNK表达虽较对照组高(P＜0.01),但较内毒素组明显下降(P=0.01),其中4h和6h处下降显著,高峰位于6h处。p-c-Jun蛋白表达趋势与p-JNK表达相似,不同的是谷氨酰胺组p-c-Jun蛋白高峰位于4h处。4、小肠PI3K、Akt mRNA和蛋白表达分析内毒素组PI3K mRNA较对照组表达明显增强(P=0.05),4h开始明显升高,6h达到高峰,其它时间点表达无明显差异。谷氨酰胺组表达明显高于内毒素组(P＜0.05)。内毒素组Akt mRNA较对照组表达无明显升高,谷氨酰胺组与内毒素组比较亦无明显升高。PI3K总蛋白表达与PI3K mRNA表达相似。p-Akt蛋白表达趋势与PI3K蛋白及Akt mRNA表达有所不同,内毒素组p-Akt蛋白较对照组表达明显增高(P＜0.01),4h开始明显升高,24h才达高峰,72h表达水平与对照组已无显著差别。谷氨酰胺组p-AKT蛋白表达明显高于内毒素组(P＜0.01),2h开始显著升高,4h达最高峰,6h后与内毒素组几乎相同。结论1、内毒素血症幼鼠小肠上皮细胞凋亡增加,增殖下降,细胞凋亡与增殖之间平衡的破坏是内毒素血症时肠屏障破坏的病理机制之一。2、内毒素血症早期,幼鼠小肠JNK/c-Jun信号转导通路被激活,导致小肠粘膜上皮细胞凋亡增加,损伤加重;晚期PI3K/Akt信号通路被激活,参与小肠上皮细胞的存活和增殖。3、谷氨酰胺通过抑制内毒素血症幼鼠小肠JNK/c-Jun信号转导通路的激活,早期促进PI3K/Akt信号通路的活化,减少细胞凋亡,促进细胞增殖,修复受损肠粘膜,从而减轻肠粘膜屏障的破坏,发挥对小肠上皮细胞的保护作用。