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在抗生素大规模发酵生产中，为保证微生物的正常生长和抗生素的高效生产，维持足量的溶氧浓度一直是一个关键问题。到目前为止，通常采用通气、搅拌等方法以增加发酵培养基中的溶氧浓度，然而这些方法常受到设备条件的制约。增大通气量和增加搅拌功率能改善溶氧，但会增加发酵生产的能耗成本。 半合成头孢菌素药物属β-内酰胺类药物，在临床上是主要的抗微生物感染药物之一，它在抗微生物感染药物中的市场份额近年来一直呈稳步上升态势。半合成头孢菌素的重要中间体之一7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是以头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)为原料制备的，因此，高效低成本地生产头孢菌素C一直是工业生产追求的目标。在头孢菌素C生物合成中有3个步骤：三肽环化酶反应、扩环反应和脱乙酰氧头孢菌素C羟基化反应都是需氧过程，因此，要获得头孢菌素C的高产，必须提供足够的溶氧，从而导致头孢菌素C发酵时的供氧能耗较高，约占发酵总成本的30％左右。因此，如果能适当地降低顶头孢霉菌的供氧能耗将大大降低头孢菌素C的生产成本。 Vitreoscilla血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，简称VHb)是迄今为止发现的唯一一种原核生物血红蛋白，它在基因结构、光谱学性质、与氧结合动力学等方面均与真核生物血红蛋白有较高的同源性或相似性。研究表明，在Vitreoscilla中，VHb的表达受氧调控，在贫氧状态下表达量大大增加。VHb基因在一些微生物中的克隆研究表明，在限氧条件下，VHb能够提高工程菌的摄氧效率、改善其生长状况并有助于提高蛋白质和次级代谢产物，尤其是抗生素的合成能力以及促进外源基因的表达等。 现代基因工程技术已运用到丝状真菌的研究中，以期获得产量提高的菌株。然而，缺乏有效的转化体系一直是制约丝状真菌基因工程研究的瓶颈。 20世纪70年代末，人们发现了利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化法，并使植物的遗传转化技术迅速发展。最近国外报道，将根瘤农杆菌Ti质粒介导转化应用于酵母以及黑曲霉、镰刀霉等真菌中。然而是否能够利用根癌农杆菌介导将VHb基因转移到顶头孢霉中还是个未知数，本文报道了一种利用根癌农杆菌介导的高效稳定的丝状真菌转化方法，率先尝试了将vgb基因克隆进头孢菌素C的工业生产菌株—顶头孢霉菌。本工作主要分以下几部分： 1．中间载体质粒pYG306的构建与鉴定 为建立优良的顶头孢霉遗传转化体系，构建vgb重组载体质粒pYG306。在新的表达载体中，含有真菌中广泛使用的构巢曲霉启动子PtrpC和相应的终止子TtrpC。在启沈阳药科大学博士学位论文摘要动子下游含有供选择用的博莱霉素(blcomycin，BLM)抗性基因和细菌来源的啥石基因。2.含双元载体系统的供体根癌农杆菌的建立 采用电激转化法和三亲杂交法，构建了根癌农杆菌(A脚bacterium tumefaciens)Ti质粒介导转化法中需要的含双元载体系统的供体根癌农杆菌(pYG306)。3.啥石基因在顶头抱霉菌中的克隆研究 用含有双元载体系统的根癌农杆菌(pYG306)与顶头抱霉原生质体共培养，在含乙酞丁香酮(AS)的条件下，可筛选博莱霉素抗性(10林创ml)转化子，而在不含AS的对照组中，没有博莱霉素抗性(10林创ml)转化子。结果表明vi;基因的诱导作用在根癌农杆菌介导的顶头抱霉原生质体转化中至关重要。其转化效率达80至140c何1护原生质体。 用含有双元载体系统的根癌农杆菌( pYG306)与顶头抱霉菌丝体共培养，在含或不含AS的条件下，均能得到博莱霉素抗性(10“创而)转化子，前者与后者的转化子比为104:44。 根癌农杆菌T-DNA介导的外源基因啥西的转化效率是PEG一Caa:介导的原生质体的转化效率的15倍.转化子质粒DNA抽提物中未发现原质粒，通过southem Blotting分析，PCR扩增、测序等证明质粒已经整合进顶头抱霉菌的染色体中。4.血红蛋白的表达及对项头袍霉发酵产物的影响。 顶头抱霉菌转化子的细胞抽提物通过CO一VHb差光谱分析，发现在42Onln处有一个与对照相比明显不同的吸收峰，表明血红蛋白在顶头抱霉菌中表达且具有生物活性，证明vgb已在顶头抱霉菌中表达。通过高效液相色谱(HPLC)对转化子摇瓶发酵产物进行分析表明，仍然合成头抱菌素C;而且转化子在供氧不足时生产头抱菌素C的能力比对照更强。说明含vgb的转化子比不含塔石对照菌更能耐受贫氧环境，合成头抱菌素C效率更高，在贫氧环境中表现出其优越性. 在装量ZOml的条件下，带有啥石基因的顶头抱霉合成头抱菌素C的能力比对照菌株(不含吵，即vgb一)提高了7.9%;而在装量40ml的条件下，其合成头抱菌素C的能力比对照(vgb)提高了36.3%。5.T-DNA介导转化法在其他丝状真菌(产黄青霉)中的作用研究 通过根瘤农杆菌(A .tumefoctens)LBA4404中T-DNA的介导将含有透明颤菌血红蛋白基因馆石和博莱霉素抗性基因转移到产黄青霉(尸chrysogenum)中。根癌农杆菌T-DNA介导的外源基因啥石的转化效率是PEG一CaC12介导的原生质体的转化效率的18.9倍。 .r，，矛苦.产了11沈阳药科大学博士学位论文摘要 透明颤菌