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本研究由四部分组成:研究一、2型糖尿病肾病患者肾组织中amylin的沉积胰淀素(amylin)可自行聚集、变性并沉积在2型糖尿病患者胰岛组织中。为证实amylin同样能够在DM患者肾脏沉积这一假说,本研究选择肾活检确定诊断的2型糖尿病肾病(DN)患者,采用人amylin单克隆抗体PAP四层法免疫组织化学染色,观察肾组织的amylin分布及病理特征;2型糖尿病患者的胰腺组织作阳性对照,无一抗为阴性对照。
该部分研究表明:amylin能够沉积在2型糖尿病肾病患者的肾脏。其与肾组织损伤程度及肾功能损伤的关系,提示amylin在2型糖尿病患者的肾脏不单是一个被动沉积的过程,它还有可能直接参与局部肾组织损伤的发生。Amylin的致病机制有待进一步研究阐明。
研究二、肾组织amylin沉积与糖尿病肾病患者临床病理的联系前述的研究证实amylin能够沉积在部分糖尿病肾病患者病损的肾组织,为阐明肾组织amylin沉积的致病作用,我们分析比较了amylin沉积组患者与amylin非沉积组患者肾脏病理、肾功能、血浆amylin水平和临床病症的变化特征,并探讨了amylin肾脏沉积的可能影响因素。血浆amylin水平的测定采用竞争酶免疫分析法,肾组织apoE组织化学染色采用免疫荧光间接法,而淀粉样P蛋白采用免疫酶标法染色,采用半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法检测尿蛋白谱。
结果发现:amylin主要沉积在有明显病损的肾小球、K-W结节内、节段硬化区和病变的肾小管基底膜。与amylin阴性患者比较,amylin肾组织染色阳性患者有更严重的肾小球结节和小管间质损伤。与此相一致的临床表现是这些患者伴有更严重的蛋白尿,贫血和肾功能损伤(P<0.05)[见表1]。其表现为:amylin沉积患者尿NAG酶、溶菌酶水平和异常增高发病率的增高以及尿渗透压的减低(P<0.05)[见表1]。与amylin非沉积组(n=42)患者比较,amylin沉积组患者(n=18)尿白蛋白的排泄显著增加(P<0.05),同时尿蛋白谱分析示:分子量为6~7万尿蛋白的百分率组成显著增高。提示amylin的肾脏沉积与白蛋白尿的形成有关。伴有肾脏amylin沉积的患者糖尿病视网膜病变和心脏病变的发生率亦显著增加(P<0.05)。amylin沉积组,非沉积组和正常人对照组amylin的血浆浓度分别为10.8±1.8、10.7±2.2(pmo]/L)和7.1±1.2(pmol/L)。amylin沉积组和非沉积组患者血浆amylin水平高于正常人对照组(P<0.001),但二者之间无显著差异(P>0.05)。apoE和淀粉样P蛋白在DN患者的肾脏沉积分布与amylin相似,而且apoE在amylin肾组织沉积组患者的沉积率(83%)显著高于阴性组(27.5%)患者。
这些结果表明:amylin不仅可沉积在DN患者的病损肾组织中,而且沉积在肾组织的amylin有明显的致病作用。肾组织amylin沉积患者不仅表现出更重的小管间质和肾功能损伤,而且糖尿病视网膜病变和心脏病变的发生率显著增加,这提示amylin很可能参与了DN患者的视网膜病变和心脏并发症的形成。apoE和淀粉样P蛋白与amylin共沉积以及apoE与amylin肾脏沉积存在的统计学关系,表明apoE和淀粉样P蛋白可能是加速amylin在肾脏沉积的影响因素。
结果表明:原代培养的人肾小球系膜细胞,经amylin(2.5μamol/L)处理48h后,在光镜和电镜下均可见细胞体积缩小、染色质浓染、致密、边移和凋亡小体形成;DNA凝胶电泳出现DNA“梯形”片断;TUNEL染色亦可见亚二倍体系膜细胞凋亡峰。定量分析示:amylin在浓度为0,0.025,0.25,2.5,25(μmol/L)时,细胞的凋亡数分别为1.9±0.72、3.1±0.89、11.1±1.25、23.2±4.7和47.6±8.6(%)(n=3),与对照组相比随amylin浓度增加而显著增加(P<0.05),提示凋亡系膜细胞数的增加与amylin呈剂量依赖性[见图2]。
通过此研究我们发现,原代培养的人肾小球系膜细胞与amylin共孵育后,呈现凋亡典型的形态学改变和生物化学特征;定量分析示:凋亡系膜细胞数的增加与amylin呈剂量依赖性;amylin处理组和对照组LDH细胞释放率无显著差异,这从多方面多角度证实了amylin对人系膜细胞具有细胞毒性作用,并可诱导系膜细胞的凋亡。amylin诱导人肾小球系膜细胞的凋亡可能是糖尿病肾病患者进行性肾小球硬化的机制。
研究四、胰淀素对血管内皮细胞屏障功能的调节糖尿病发病和死亡的主要原因是其血管并发症。内皮细胞功能的紊乱在糖尿病血管病变的形成过程起关键性作用。但是,迄今为止内皮细胞功能紊乱的病理机制仍不清。我们以往已证实2型DM患者amylin水平增高,增高的amylin除沉积在肾脏参与DN的发病外,还与DM的心脏和视网膜眼底病变有关。因此,本研究旨在观察amylin对血管内皮细胞屏障功能的影响。人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)购自ATCC。采用共培养技术观察amylin对HUVEC通透性的影响。通透性用生物素标记的白蛋白跨内皮细胞单层的通透率表示。用囊泡结构特异性探针FM1-43标记内皮细胞囊泡结构,在激光共聚焦显微镜下观察并进行定量测定。
结果发现:内室单层内皮细胞在amylin浓度为0,0.1,1,10,100和1000(nmol/L)的处理12h后,内皮细胞白蛋白通透率分别是:5.8±0.80、6.1±0.42、9.4±0.35、18.2±1.72、22.7±3.9、14.1±2.3(%)(n=3),随amylin浓度的增加白蛋白通透率相应增加。而amylin(100nmol/L)与内皮细胞共孵育在0、0.25、0.5、1、3、6、12(h)白蛋白通透率分别是:5.4±0.3、5.8±0.5、6.3±1.1、9.8±0.6、11.6±0.3、16.9±1.6、20.2±5.1(%)(n=3),随amylin作用时间的延长白蛋白通透率亦相应增加。内皮细胞胞浆内囊泡结构在特异分子探针染色后清晰可见[图3A]。浓度为0、0.1、1、10、100(nmol/L)的amylin与内皮细胞共孵育2h后,囊泡吞噬结构染色的平均荧光强度分别是:202±26、230±39、361±41、456±57、720±84和570±66(n=3)。amylin(100nmol/L)处理后与处理前相比,同一群内皮细胞囊泡结构染色的荧光强度明显地增加。伴有BSA的培养液培养的内皮细胞囊泡结构的荧光染色强度较无BSA组以及amylin加BSA组较单纯BSA组对比,均显著增高(n=3)(P<0.01)。而amylin、IgG分别与无BSA对比以及IgG加BSA组与BSA组对比均无显著性差异(P>0.05)。
该研究结果表明:(1)amylin能够增加内皮细胞白蛋白的通透率,该作用呈剂量和时间依赖性;(2)amylin可通过增加内皮细胞囊泡转运的机制而增加内皮细胞的通透性。该研究为amylin参与糖尿病慢性血管并发症的形成和发病提供了体外实验证据。
本论文研究工作表明:1.2型糖尿病肾病患者伴有血液amylin水平的增高和肾组织amylin的沉积。
2.伴肾组织amylin沉积的2型糖尿病肾病患者较无肾组织amylin沉积患者,有更显著的肾小管间质损伤、更严重的贫血和肾功能损害。肾组织amylin沉积患者糖尿病视网膜病变和心脏病变的发生率亦显著增加,这提示amylin很可能参与了DN患者的视网膜病变和心脏并发症的形成。apoE和淀粉样P蛋白可能是加速amylin在肾脏沉积的影响因素。
3.amylin能够诱导系膜细胞的凋亡。amylin的致人系膜细胞凋亡作用可能是糖尿病肾病患者进行性肾小球硬化和系膜细胞逐渐消失的机制。
4.amylin能够通过加速内皮细胞囊泡转运的机制而增加内皮细胞的通透性。该研究为amylin参与糖尿病慢性血管并发症的形成和发病提供了实验证据。