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机体被流感病毒感染后可引起呼吸系统不同程度的损伤。根据世界卫生组织的数据显示,季节性流感病毒（A型H1N1和H3N2流感病毒,以及B型流感病毒）每年在全球范围内造成大约300万至500万例重症病例和29万至65万人死亡。此外,禽流感病毒H5N1和H7N9,已具备了人畜共患特征。随着季节变化和生态改变,常引起跨物种传播,最终导致新型流感病毒株的大流行,造成无数人感染。世界卫生组织每年召开两次流感疫苗组份推荐会（一次针对北半球,另一次针对南半球）,试图根据流行病毒的基因和抗原特征以及各国的流行病学信息来选择正确的疫苗。由于疫苗株是在每个流行季之前6个月左右确定的,偶尔会出现候选疫苗株和流行毒株之间抗原不匹配。因此,需要做好准备应对新型流感病毒。m RNA疫苗可以用作一种应对新发突发传染病的应急疫苗,而且相比传统灭活疫苗和减毒活疫苗等其他类型疫苗具有许多优势。为此,本文主要开展流感病毒m RNA疫苗的制备与实验免疫研究。1. 季节性流感病毒的分离与鉴定由于季节性流感病毒的持续进化,使它们能够逃脱先前感染或接种疫苗引起的免疫。因此,本研究选择在流感病毒流行季节的高峰期2018.12.28～2019.1.31和2019.11.20～2019.12.31期间,采集156份咽拭子样本并对拭子中可能含有的流感病毒进行PCR鉴定,共检测出9份H1N1亚型流感病毒,36份H3N2亚型流感病毒和6份B型流感病毒。通过接种SPF级鸡胚来分离流感病毒,共分离出1株A型H1N1流感病毒,抗原血凝效价为1:512,对11周龄雌性C57BL/6小鼠的半数致死剂量(LD50)为10-3.625/0.1m L,将其命名为A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）;同时,分离出4株A型H3N2流感病毒,将其分别命名为A/Jilin/15/2019（H3N2）、A/Jilin/37/2019（H3N2）、A/Jilin/43/2019（H3N2）和A/Jilin/73/2019（H3N2）。将所有分离株的HA基因与同年WHO推荐的同型候选疫苗株的HA基因进行对比,发现关键抗原表位处的氨基酸均有多处发生改变。2. m RNA候选疫苗体外转录系统的构建与筛选为了构建高效表达外源目的基因的m RNA疫苗,需要对m RNA疫苗的体外转录（IVT）表达系统进行优化。本研究主要分析5’和3’非编码区（UTR）元件对m RNA翻译效率的影响,共设计三种模式的5’UTR-MCS-3’UTR-poly A（120）,区别在于UTRs序列不同,分别命名为IVT-m RNA-n1、IVT-m RNA-n2和IVT-m RNA-n3。在IVT-m RNA-n1中5’与3’UTR均源自人-α球蛋白;IVT-m RNA-n2和IVT-m RNA-n3中5’与3’UTR均源自人-β球蛋白,但在IVT-m RNA-n3中5’UTR序列前端又添加一段调控序列。选用EGFP和H3N2-HA基因作为筛选最佳体外转录系统的工具基因,利用流式细胞术测定EGFP阳性细胞率,利用Western Blot验证HA蛋白的表达量差异,最终筛选出最优的系统:IVT-m RNA-n3。而且,利用该系统在6种不同细胞系中均能成功表达EGFP,证实该系统具有在多种细胞系中应用的可能性。3. m RNA候选疫苗脂质体纳米材料的制备及功能验证为了防止m RNA被降解,人们构建了大量的纳米级生物材料来递送m RNA。阳离子脂质纳米粒能够通过静电吸附作用结合m RNA,同时保护m RNA免受核酸酶的降解,并通过膜融合方式将m RNA递送到细胞内。在脂质体纳米颗粒的基础上,可以对其表面进行修饰,使纳米颗粒具有一定的靶向性,更精准地发挥作用。甘露糖受体表达在抗原递呈细胞表面,尤其是巨噬细胞和树突状细胞。树突状细胞在免疫系统中发挥关键作用,可以连接固有免疫和适应性免疫应答。本研究制备了两种阳离子脂质体纳米颗粒（LNP）和LNP-Man（甘露糖修饰）,对其形态、粒子直径、电位、细胞毒性和结合m RNA的能力进行了测定。通过体外细胞转染和动物体内转染实验对其功能进行评价。体外细胞实验表明,LNP和LNP-Man能够保护m EGFP不被降解并可以将其递送到细胞内完成翻译。小鼠体内递送编码萤火虫荧光素酶的m RNA,无论采取腿部肌肉注射还是滴鼻途径,均能够在给药部位看到荧光,说明制备的LNP和LNP-Man能够将m RNA递送到体内细胞,并有效表达目的蛋白。通过对比分析荧光值的强度,LNP-Man组均高于LNP组,说明经过甘露糖配体修饰的脂质体纳米颗粒能够有效增强体内细胞对m RNA的摄取。4. A型H1N1、H5N1和B型流感病毒m RNA候选疫苗构建及实验免疫研究通过将前期分离的流感病毒与同年WHO推荐的疫苗株比对后发现,HA基因的多处关键抗原位点的氨基酸存在差异,推测可能分离株的抗原性发生了变化,与疫苗株不匹配。因此,有必要重新制备疫苗来预防和控制新型流感病毒。本研究除了对分离株:A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）进行研究外,还对实验室现有保存株:A/chicken/Jilin/9/2004（H5N1）和B/Beijing/1112/563进行研究,以各株的HA基因作为抗原基因,分别构建每株流感病毒特异性的LNP/m HA和LNP-Man/m HA疫苗,并在动物模型C57BL/6小鼠上进行实验免疫研究和攻毒保护评价。结果表明,三组疫苗均具有良好的免疫原性,能诱导小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫应答;三株流感病毒分别以10×LD50剂量对小鼠进行滴鼻攻毒,疫苗组LNP/m HA和LNP-Man/m HA的保护率分别为:H1N1组（100%和100%）;H5N1组（66.7%和66.7%）;B型流感病毒组（83.3%和100%）。本研究为m RNA疫苗的设计和免疫策略的制定提供了实验和理论依据。