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目的:定点突变人干扰素-α2b(hIFN-α2b)基因的5’端序列,构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核高表达载体pJW2-rhIFN-α2b,转化至大肠杆菌DH5α,BL21,Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞,分析不同宿主菌对其表达量的影响,经SDS-PAGE,Western blot鉴定获得重组人干扰素-α2b的高表达工程菌pJW2-rhIFN-α2b/BL21。
方法:依据大肠杆菌密码子偏好性,在不改变hIFN-α2b的氨基酸序列的情况下,定点突变hIFN-α2b基因5’端序列并PCR扩增出rhIFN-α2b,克隆至pUC19,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝-白斑筛选及测序验证正确,将rhIFN-α2b克隆至温控型表达载体pJW2,NdeⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR验证正确后,分别将pJW2-rhIFN-α2b和pJW2-rhIFN-α2b转化至大肠杆菌DH5α,BL21,Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞,30℃过夜培养,42℃温度诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析宿主菌DH5α,BL21,Rosetta-gami B(DE3)对目的蛋白表达的影响进而选择大肠杆菌BL21为其宿主菌;挑取pJW2-rhIFN-α2b/BL21单菌落,30℃过夜培养,42℃温度诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE,Western blot鉴定分析并以WISH细胞-VSV病毒系统的细胞病变抑制法(CPE)测定表达蛋白的抗病毒活性及其效价。
结果:NdeⅠ/BamHⅠ双酶切、PCR验证及测序结果证实pJW2-rhIFN-α2b构建成功;SDS-PAGE分析表明pJW2-rhIFN-α2b(BL21)比pJW2-rhIFN-α2b(DH5α),pJW2-rhIFN-α2b(Rosetta-gami B(DE3))的hIFN-α2b表达量高;SDS-PAGE分析表明pJW2-rhIFN-α2b/BL21表达的rhIFN-α2b约占菌体总蛋白23.6%,Western blot表明rhIFN-α2b具有与hIFN-α2b相同的免疫原性,纯化的rhIFN-α2b经WISH细胞-VSV病毒系统证实其比活性达1.2×108 IU/mg。
结论:成功构建出5’端突变的rhIFN-α2b原核高表达工程菌pJW2-rhIFN-α2b(BL21),可提高其在大肠杆菌中的表达水平。