里氏木霉(Trichoderma reesei)是重要的纤维素酶产生菌,也是用于研究丝状真菌纤维素酶合成调控机制的常用菌株,其中的纤维素酶合成调控机理已获得了较充分的认识。Micro RNA(miRNA)广泛存在于各种生物中,能够与靶mRNA特异性结合对基因表达进行调控。近年来,与miRNA结构相似的小分子RNA(micro RNA-like RNA,milRNA),在多种真菌中通过高通量测序分析后被鉴定,如粗糙脉胞菌、核盘菌、黑僵菌以及里氏木酶等。然而,关于里氏木酶miRNA或milRNAs研究的报道较少。本研究以课题组前期对里氏木酶高通量测序得到的13个milRNAs为基础,根据milRNAs在诱导和非诱导条件下的表达水平,选取了4个里氏木酶QM9414的milRN A进行功能研究。根据已获得的milRNA序列信息,设计milRNA的Tough Decoy(TuD)序列以及PCR扩增过表达序列,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析;并利用里氏木酶强组成型启动子Ppdc构建milRNA抑制表达载体和过表达载体,将载体转入里氏木酶进行原生质体转化后表达。筛选构建成功的重组菌培养于纤维素酶诱导培养基,利用荧光定量PCR检测milRNA、酶基因cbh1、egl1的表达水平,测定滤纸酶活(FPA)以及羧甲基纤维素酶活(CMCA),探讨milRNA是否调控纤维素酶的表达,分析milRNA与纤维素酶表达调控的相关功能关系。再将调控效果明显的milRNA重组菌进行培养基碳氮源组分的优化培养,测定纤维素酶调控因子cre1、xyr1的表达量以及滤纸酶活,进一步提高重组菌株的纤维素酶活。研究结果表明,milR4、milR9参与了纤维素酶的表达调控。荧光定量PCR数据显示,抑制表达的菌株milRNA表达水平降低,说明TuD序列发挥了抑制作用;过表达菌株milRNA表达水平提高,说明成功扩增了milRNA的前体序列。酶活测定结果显示,各个菌株在诱导培养120 h后达到最高值。其中,过表达菌株P-milR4酶活是原始菌株的0.919倍,并有下降的趋势;抑制表达菌株TuD4酶活有一定提高,是原始菌株的1.228倍,milR4参与了纤维素酶表达的正调控。抑制表达菌株TuD9酶活是原始菌株的0.946倍,过表达菌株P-milR9酶活提高明显,是原始菌株的1.349倍,milR9参与了纤维素酶表达的负调控。对纤维素酶产酶培养基进行优化后,得到一株产酶量相对较高的重组菌P-milR9,其酶活为原始菌株的1.454倍。本工作通过构建TuD抑制表达载体和过表达载体得到的小分子RNA:milR4和milR9能显著改变T.reesei纤维素酶酶活;并通过优化培养基进一步提高了重组菌株P-milR9的纤维素酶活。本工作为研究里氏木霉中的小分子RNA调控机制提供了新认识,并为进一步提高T.reesei纤维素酶酶活提供新的方法。