棉花是世界上的重要经济作物,棉纤维是纺织工业中天然纤维的主要来源,棉花还是重要的战略物质。随着纺织工业的迅猛发展,棉花的需求量逐年递增。目前,棉花的品种改良在很大的程度上改善了棉花的产量和品质,但是棉花蕾铃脱落的现象很普遍。研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,从分子水平研究蕾铃脱落的机制,克隆在离层特异表达的基因,不仅可以深入认识棉花蕾铃脱落的分子机理,还可以为改良棉花产量的遗传工程奠定物质基础。为研究棉铃脱落的机制,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,通过构建抑制差减杂交(SSH)文库的方法,筛选出在离层表达的基因。
　　取得的主要研究结果如下:
　　1.采用赤霉素(gibberellin,GA3)和乙烯利(ethephon,CEPA)2种激素,分别设置3种浓度(GA3:10ppm、50ppm、100ppm;CEPA:10ppm、250ppm、1000ppm)处理,在TM-1开花当天点涂棉铃铃柄,7天后调查脱落率。赤霉素处理,在2006年,10ppm和50ppm与对照差异均显著,而100ppm处理与对照无显著差异:2007年,3种处理与对照差异均显著。乙烯利处理,在2006年,250ppm和1000ppm与对照差异均显著,而10ppm处理与对照无显著差异;2007年,3种处理与对照差异均显著。赤霉素各浓度处理效果在年份间差异很大,说明气候条件对赤霉素的作用有很大影响。
　　2.50ppm赤霉素处理有显著的保铃效果,250ppm乙烯利处理能显著促进棉铃的脱落。我们以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,构建了两个离层组织的抑制差减杂交(SSH)cDNA文库。来自于50ppm赤霉素和250ppm乙烯利处理开花当天的棉铃离层cDNA分别作为两个SSH文库的Tester,涂水对照开花当天的棉铃离层cDNA作为两个文库的Driver。反向Norethern杂交在两个文库中筛选克隆,测序了80个克隆,序列分析共产生28条单一序列。在分析的EST中,已知功能的序列包括翻译相关、信号转导、代谢相关、转录相关、能量代谢、蛋白合成和抗逆相关基因,其中有29％是与翻译相关的核糖体基因,这说明了在激素处理后,离层有大量的蛋白质合成。另外,与信号转导和代谢相关的基因占14％,与转录相关的基因占11％。
　　3.为了分析离层优势表达基因的时空表达模式,我们从文库中挑选了10个基因进行了RT-PCR分析。查尔酮合酶基因(Chalcone synthase,CHS)在每个组织不同时期均有表达,但表达量有差异,在赤霉素处理2h后的离层中表达较高。缩氨酸异构酶基因(Cytosolic cyclophilin,ROC3)在根、茎中表达很强,在叶、离层各时期表达较弱,在赤霉素处理2h后的离层中不表达。
　　肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)在根、茎中表达很强,在叶中几乎不表达,在赤霉素处理0.5h后微弱表达,12h后表达达到最强。