论文部分内容阅读
蛋白质表达过程中,不同标签肽(如His-Tag、FLAG-Tag)、蛋白(如GST、MBP)往往需要被融合到目标蛋白的氨基端或羧基端以提高目标蛋白的表达产率、可溶性,实现蛋白纯化。然而被融合的标签肽、蛋白最终往往需要从目标蛋白上切掉。目前唯一的生物兼容性蛋白剪切方法是生物酶切,虽然已经有多种不同的哺乳动物酶用于生物酶切,例如凝血因子Xa,肠激酶和β-凝血酶,但是,据报道在某些特定情况下这些酶不具有高度特异性且存在脱靶效应。而TEV蛋白酶(TEVp)具有良好的活性和序列特异性,在应用方面得到了高度重视。此外,由于TEVp的多项特征性使它可以应用于多种生物技术中,从简单和经济的生产到开源载体和突变体的可用性,以及适用于体外和体内的各项研究。由于TEVp在大肠杆菌中表达时主要以包涵体的形式存在,且存在自剪切现象,导致其难以获得,从而限制了它的应用范围。目前,为了提高TEVp的可溶性和稳定性,已有许多方法用于改进TEVp在大肠杆菌中的表达情况,例如密码子优化、融合表达助溶标签、定点突变等。几种常见的助溶标签的效果却并不完美,例如MBP虽然能增加TEVp的可溶性但不能提高其表达量,Trx标签对TEVp的表达量和可溶性均没有明显改善,GST融合的TEVp表达量虽然有所增加却不能提高TEVp的可溶性。所以本研究首先期望能找到更合适的标签既能提高TEVp在大肠杆菌中的表达量,也能增加它的可溶性。为了提高TEVp的活性,目前报道了许多TEVp的突变体。在体外的应用中,报道的一个效果比较好的突变体是TEVp6M(T17S/L56V/N68D/I77V/S135G/S219V/△238)。而在真核细胞的应用中,最近报道了两种活性较好的TEVp。其中一个TEVp的突变体为sec TEVp-QSG,该突变体在TEVp的两个N-糖基化位点和一个暴露的半胱氨酸上引入了突变(Asn23Gln,Thr173Gly,Cys130Ser),体内的活性实验表明该突变体在内质网中具有较高的活性。另外一种是在酵母细胞中,通过多次突变筛选发现的一种酶切活性更高的TEVp突变体,其酶切效率是普通TEVp的四倍,被命名为TEVp-Fast。在TEVp-Fast中,除了含有避免自酶切的Ser219Val突变位点以外,还包含另外两个点位点突变(Gly79Glu和Thr173Ala)。为了获得更高的酶切活性的突变体,本研究希望确定这些位点在体外是否也同样可以促进TEVp的活性。另外,在使用的过程中发现,TEVp很容易失活,在-80℃保存时间久后也会失活。为了提高TEVp的稳定性和使用率,本研究希望利用固定化的方法提高TEVp的稳定性,扩大使用范围。本实验围绕上述三个方面展开研究工作,取得以下结果:(1)本实验使用CBD作为TEVp的助溶标签,与MBP标签相比,在大肠杆菌中大量表达时,CBD标签不仅增加了TEVp的表达量也提高了TEVp的可溶性,最终将TEVp的产率提高了1倍。(2)在实验室现有的TEVp6M(T17S/L56V/N68D/I77V/S135G/S219V/△238)基础上,首先通过定点突变引入了Thr173Ala,然后再单独或同时引入Gly79Glu和Cys130Ser,得到三个新的TEVp突变体:TEVp7ME,TEVp7MS和TEVp9M。通过比较突变体与TEVp6M的活性与稳定性,发现TEVp9M在4℃和25℃具有更好的活性,同时在25℃和37℃具有更好的稳定性。(3)CBD-TEVp可以通过CBD与纤维素结合实现TEVp的固定化。固定化的CBD-TEVp的活性与游离态的TEVp相比,活性略有损失,但是可以通过增加使用次数,提高TEVp的使用效率。(4)使用固定化的TEVp可以减少后续再除去生物酶的纯化步骤,可以实现一步去除亲和标签获得目的蛋白,简化实验步骤。