基于宏基因组测序技术的南方核心产区黄酒发酵剂微生物群落和基因多样性研究

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黄酒是我国特色酒类,风味独特,其独特的曲法酿酒和“双边发酵体系”是传承千年的文化瑰宝。目前,黄酒行业正处于结构性变化阶段,机械黄酒产业规模不断扩大,但纯种发酵导致机械黄酒存在口味寡淡、香气单薄等问题,因而需研究黄酒发酵剂微生物群落结构和基因多样性及风味物质代谢途径,为机械黄酒风味品质提升提供理论基础。本研究以中国黄酒南方核心产区不同发酵剂为研究对象,利用宏基因组测序手段,组装构建了黄酒发酵剂基因集,基于NR、egg NOG、KEGG和CAZy注释结果比较了不同发酵剂物种组成和功能基因的差异;研究了不同黄酒发酵剂所酿制黄酒的理化指标、挥发性化合物和非挥发性化合物含量的差异;解析了黄酒主体风味化合物生成相关催化酶与复杂微生物组成的联系,构建了黄酒主体风味物质代谢网络。主要研究结论如下:(1)构建了黄酒发酵剂基因库,共计获得非冗余基因unigenes 2,451,227条。根据NR数据库比对结果,黄酒发酵剂微生物群落主要由真菌和细菌构成,纯种发酵剂中真菌(84.9%)相对丰度高于细菌(8.3%),混菌发酵剂中细菌(50.6%)相对丰度较高。酵母属、糖多孢菌属和曲霉属是不同黄酒发酵剂主要的差异菌属,其中,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)和米曲霉(Aspergillus oryzae)为主要差异菌种。经过egg NOG数据库比对,混菌发酵剂在代谢过程分类中的各功能基因的相对丰度均高于纯种发酵剂,而在细胞信号分类中的各功能基因的相对丰度低于纯种发酵剂。与KEGG数据库进行比对,黄酒发酵剂微生物Level1水平上六大类代谢通路相关基因存在显著差异,混菌发酵剂有更丰富的与代谢相关的基因。在Level 2水平上,共注释到46小类代谢通路,碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢是黄酒发酵剂中重要的代谢通路。通过比对CAZy数据库,发现黄酒发酵剂中糖基转移酶(36.9%)、糖苷水解酶(35.4%)和碳水化合物酯酶(14.9%)的相关基因丰度较高。纯种发酵剂中,与碳水化合物分解有关的糖苷水解酶丰度较高;混菌发酵剂中,与酯类合成或水解有关的碳水化合物酯酶丰度较高。(2)不同发酵剂所酿制黄酒的香气(酯香、甜香、果香、曲香和酸香)和滋味(酸、甜、苦、涩和后苦)差异显著,总酸、氨基酸态氮、酒精度和总糖含量有差异,但均在国标要求范围内。利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和高效液相色谱(HPLC)技术在黄酒样品中共检出128种代谢物,包括104种挥发性化合物,7种有机酸和17种氨基酸。基于检出的代谢物进行了主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和层次聚类分析(HCA),不同发酵剂酿制黄酒代谢物含量差异显著,可分为纯种发酵黄酒和混菌发酵黄酒两大类,利用变量投影重要性(VIP)值,筛选出具有显著差异的酯类、醇类和酸类等物质。将差异挥发性物质与香气属性进行皮尔森相关性分析得到:2-氨基-5-甲基苯甲酸、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯、2-叔丁基苯酚、甲酸己酯、壬二酸二乙酯、十五酸乙酯、2-苯基苯并噻唑、月桂酸乙酯、乙酸乙酯、异戊醇以及十四酸乙酯与黄酒整体香气相关性较强。(3)以黄酒主体风味物质为出发点,通过与KEGG PATHWAY数据库中已知的代谢通路进行比对,对与黄酒主体风味物质生成相关代谢途径中的催化酶进行梳理得到:黄酒发酵剂微生物基因组中共注释出相关催化酶231类,相关微生物菌属154种。建立了黄酒风味物质代谢与微生物菌属代谢网络,揭示了葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和乙酰Co A为黄酒风味物质代谢网络的骨架。根据NR数据库注释结果,发现曲霉属、酵母菌属、乳杆菌属、乳球菌属、糖多孢菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、泛菌属、根霉属、横梗霉属、假单胞菌属、链霉菌属、明串珠菌属、片球菌属和葡萄球菌属是与黄酒主体风味物质生成密切相关。
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