第一部分瑞芬太尼痛觉过敏及激活脊髓α 7nAChRs对瑞芬太尼痛觉过敏行为学的影响对于急性慢性疼痛的治疗,阿片类药物目前仍是最为主要的治疗措施。静脉内注射阿片受体激动剂,如芬太尼、阿芬太尼、舒芬太尼、瑞芬太尼等是日常手术麻醉过程中最常用的镇痛方式,其在手术麻醉的维持中占主导地位。临床使用此类药物的过程中发现,停用阿片类药物后会使得患者出现痛觉过敏。此种痛觉过敏不仅增加了术后镇痛药物的用量,而且加重了患者术后不适并影响患者的术后恢复。阿片药物所诱发的痛觉过敏OIH(opioid-induced hyperalgesia)是指暴露于阿片药物的患者出现一种以痛阈降低及对正常刺激的过激反应为特点的感觉异常现象。瑞芬太尼作为超短效μ阿片受体激动剂,具有镇痛作用强,起效快、作用时间短、消除迅速、连续输注无蓄积,代谢不依赖于肝肾功能的特点,在临床麻醉中应用广泛。但是对临床应用瑞芬太尼的研究发现,瑞芬太尼在提供良好的镇痛效果的同时,可诱发停用后的患者痛觉过敏。且其超短效的药理学特性,使瑞芬太尼痛觉过敏加重了患者不适,影响患者术后康复,限制了该药在临床的应用。对于瑞芬太尼痛觉过敏的研究表明,其发生与多种机制及信号传导通路有关,但是其确切的发生机制仍未阐明。α7亚型乙酰胆碱受体(α7nAChRs)可介导中枢及外周神经胶质细胞的免疫反应。对中枢及外周神经胶质细胞的研究发现,α7nAChRs激动剂能够明显降低神经胶质细胞促炎性产物的生成。在炎性疼痛及神经病理性疼痛中,激活α7nAChRs可降低此类动物模型的痛觉过敏现象。但α7nAChRs在阿片类药物所致的痛觉过敏中的作用仍未见有相关报道。在本实验中,我们采用Brennan法,制备标准大鼠切口痛模型。在模型制备的过程中,皮下泵注瑞芬太尼40μg/kg,输注时间为30min,制备瑞芬太尼痛觉过敏模型。通过鞘内注射α7nAChRs的激动剂及变构激活剂,探讨脊髓α7nAChRs激活对瑞芬太尼痛觉过敏的影响。对痛行为学的评定我们采用两种方式,即大鼠机械缩足反射阈值(Paw Withdrawal Mechanical Threshold, PWMT))和大鼠热缩足潜伏期(Paw Withdrawal Thermal Latency, PWTL)。对瑞芬太尼痛觉过敏行为学的测定在分别在术前24h(基础值),术后的2h,6h,24h,48h进行。α7nAChRs激动剂与变构激活剂的注射时间选在瑞芬太尼痛觉过敏较为稳定的术后24h,并在注射后0.5h,1h,2h,4h,6h检测行为学变化。结果显示1、术中泵注瑞芬太尼可诱发显著的术后痛觉过敏；2、α7nAChRs激动剂(PHA-543613)及Ⅱ型变构激活剂(PNU-120596)可剂量依赖性抑制瑞芬太尼痛觉过敏,但Ⅰ型变构激活剂(NS-1738)则无此效应；3、PHA-543613和PNU-120596的镇痛作用可被α7nAChRs拮抗剂MLA阻断；4、亚镇痛剂量的α7nAChRs激动剂及Ⅱ型变构激活剂联合注射亦可抑制瑞芬太尼痛觉过敏。综上所述,本实验采用切口痛模型制作过程中泵注瑞芬太尼制备瑞芬太尼痛觉过敏模型,并首次研究了脊髓α7nAChRs的激活对瑞芬太尼痛觉过敏的作用。结果表明,α7nAChRs激动剂和Ⅱ型变构激活剂及两者的联用可抑制瑞芬太尼痛觉过敏,但Ⅰ型变构激活剂无此效应。本研究为寻找并确定治疗瑞芬太尼痛觉过敏药物作用靶点提供了新的实验依据。第二部分脊髓α 7nAChRs激活抑制瑞芬太尼痛觉过敏机制的研究疼痛是由于外围到大脑皮层感通路可塑性的变化所引起,中枢及外周的免疫细胞均在此过程中发挥着重要作用,参与了疼痛的发生及维持。脊髓小胶质细胞及星形胶质细胞是中枢神经重要的免疫相关细胞,激活的胶质细胞及其释放的促炎性产物目前被认为是疼痛过程中参与疼痛维持的重要因素。因此,对激活的胶质细胞及其促炎性反应产物的抑制可作为治疗疼痛的靶点。脊髓水平α7nAChRs在星形胶质细胞和小胶质细胞中均有表达。研究显示,通过激活α7nAChRs,可以下调促炎性因子的合成,在多种疼痛模型中产生明显的抗伤害效应。结合课题组之前对于促炎性因子在瑞芬痛觉过敏中作用的研究,提示激活脊髓α7nAChRs可能通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞以及胶质细胞源性的多种细胞因子而产生镇痛作用。在痛觉敏化形成以及维持的过程中,突触传递的兴奋性传导通路增强是其中重要的组成部分。大量的研究证明,N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)在兴奋性突触中传递过程中发挥核心作用。阿片类药物所诱发的痛觉过敏与脊髓水平NMDA受体过度激活密切相关。我们团队的前期研究发现,瑞芬太尼痛觉过敏可增加脊髓水平酪氨酸磷酸化NR2B(功能型NMDA受体亚基)的表达。脊髓α7nAChRs的激活能否通过减弱酪氨酸磷酸化NR2B的表达,抑制兴奋性传导通路增强,从而缓解瑞芬太尼痛觉过敏,仍未见有相关文献报道。疼痛产生及维持的过程中,兴奋性通路增强的同时,抑制性通路的减弱也参与了痛觉敏化的过程。中枢神经元的突触抑制是通过Y-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)介导。GABAAR和GlyR通过通透阴离子,如氯离子(Cl-)和碳酸氢根离子(HCO3-),发挥抑制性作用。神经元氯离子的稳态是通过K+-Cl-协同转运蛋白2(KCC2)的跨膜转运以维持。KCC2将Cl-顺着K+的浓度梯度移出细胞外,从而保持细胞内较低的Cl-浓度,这是GABAAR和GlyR发挥抑制性效应的先决条件。脊髓胶质细胞激活后释放的脑源性神经营养因子(BDNF),通过结合神经元受体酪氨酸受体激酶B (TrkB)快速下调KCC2的表达,从而减少C1-的胞内向胞外转运,消弱GABAAR和GlyR的抑制性作用。这些结果提示,激活脊髓α7nAChRs可能通过抑制BDNF-TrkB信号通路,增强抑制性通路的活性,从而缓解瑞芬太尼术后痛觉过敏。因此,结合第一部分行为学结果,本部分实验研究α7nAChRs激动剂及Ⅱ型正性变构激活剂(Positive allosteric modulator, PAMs)抑制瑞芬太尼痛觉过敏作用机制。通过三个方面：1、α7nAChRs激动剂及Ⅱ型PAMs对瑞芬太尼痛觉过敏中脊髓小胶质细胞、星形胶质细胞及促炎性产物的影响；2、α7nAChRs激动剂及Ⅱ型PAMs对瑞芬太尼痛觉过敏中脊髓络氨酸磷酸化NR2B (p-NR2B)的影响；3、α7nAChRs激动剂及Ⅱ型PAMs对瑞芬太尼痛觉过敏中脊髓BDNF的影响。分别阐明激活脊髓α7nAChRs后,胆碱能抗炎通路,兴奋性传递通路,抑制性传递通路的改变在抑制瑞芬痛觉过敏中的作用。结果表明,激活脊髓α7nAChRs可显著降低小胶质细胞,星形胶质细胞,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)及p-NR2B和BDNF的表达。综上所述,本实验首次研究并报道了激活脊髓α7nAChRs抑制瑞芬太尼痛觉过敏的可能机制。研究显示,神经胶质细胞及促炎性因子的减弱,兴奋性传导通路的抑制,抑制性传导通路的增强,这些机制均参与了激活脊髓α7nAChRs对瑞芬太尼痛觉的抑制作用。这一结果为寻找合理防治瑞芬太尼痛觉过敏的方案提供了新的理论和实验依据。