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1.铁结合蛋白
铁结合蛋白(ferric-ion binding protein,Fbp)是革兰氏阴性菌表达的含有309个氨基酸的蛋白,它位于细胞质内,是致病菌获取铁的主要蛋白。它通过一个组氨酸(His9)、一个谷氨酸(Glu57)和两个酪氨酸(Tyr195、Tyr196)与Fe3+结合,另有一个磷酸根作为协同阴离子,一个水分子作为第六个配体,将Fe3+跨过胞质运送到细胞质膜。研究发现两个酪氨酸是Fbp结合Fe3+关键位点,而协同阴离子的参与也很重要。
本论文为考察酪氨酸结合位点对Fbp结合Fe3+的能力的影响,表达、纯化了单突变体蛋白Y195F、Y196F和双突变体蛋白Y195F/Y196F,利用紫外-可见光谱研究了Fe(NTA)与Y195F间的作用,发现holo-Fbp中的特征吸收峰从481nm红移到468nm,表明反应形成了Fe-Y195F-NTA三元络合物,NTA是协同阴离子,每个突变体蛋白平均结合约0.5个Fe3+。滴定实验测得表观结合常数为3.1×104L·mol-1(10mmol·L-1 Hepes缓冲溶液,pH7.4,298K)。
实验室前期研究和一些文献报道还发现Fbp具有催化磷酸酯水解的功能,为研究该催化反应的机制,我们将apo-Fbp及其突变体Y195F、Y196F在10mmol·L-1 Hepes缓冲溶液中293K下与PPi反应,发现pH6.5、7.5、8.5时,Y196F催化磷酸键的断裂的速率常数分别为1.05 mmol·L-1·h-1、1.11 mmol·L-1·h-1、1.22×10-2 mmol·L-1·h-1,与apo-Fbp催化磷酸键水解的能力相近,但相应pH下,Y195F比apo-Fbp弱约10倍。同时,Dotblot试验(nc膜,磷酸根-酪氨酸抗体为一抗,驴抗鼠二抗)显示,apo-Fbp、Y195F、Y196F与PPi的反应产物都结合了磷酸根,但双突变体Y195F/Y196F不能结合磷酸根,证实Fbp催化焦磷酸水解的机制是主要通过Fbp中的铁的结合位点Tyr195的磷酸化来进行的。
2.铁调素
铁调素(hepcidin,HEP)是由肝细胞分泌的调节细胞中铁的代谢平衡的激素肽。它含有25个氨基酸残基并且富含半胱氨酸,受细胞中铁浓度和感染正调控,而受贫血和缺氧负调控,它与血沉症、神经退行性疾病等铁蓄积相关疾病密切相关。
本论文通过克隆将hepcidin-25 cDNA与载体pMal-C2X连接,构建了表达体系,然后转化大肠杆菌BL21 DE3表达融合蛋白MBP-hepcidin-25。经过层析柱分离后获得了一个分子量为46000Da的可溶性蛋白,通过TEV消化酶等酶进行酶切有望获得HEP-25单体,为研究HEP调控细胞铁代谢的分子机制奠定了基础。
3.锰超氧化物歧化酶
锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)是真核细胞的线粒体中表达的一种重要的抗氧化酶,通过催化超氧化离子自由基O2-的歧化反应保护细胞免受氧化应激的损伤。
本论文构建了MBP-MnSOD质粒并将其转化大肠杆菌Rossetta DE3 plus,然后用IPTG诱导表达,经过Amylose亲和柱和排阻层析的分离纯化,获得了可溶性的融合蛋白MBP-MnSOD,通过酶切可获得MnSOD,为MnSOD以及Mn的相关生物功能和体内代谢机制的研究奠定了基础。