细胞膜作为重要的生物表界面,承载着诸多生命过程,基于细胞膜的生物医学基础研究和创新应用日益增多,显示了细胞膜界面的独特意义和重要价值。在细胞膜界面上,最为显著的结构特征就是跨膜不对称性,涉及到构成细胞膜的磷脂、蛋白质和糖类等各种分子。以往对细胞膜跨膜不对称性的研究常常将关注点集中在膜蛋白上,一定程度上忽视了同样重要的磷脂跨膜不对称性。这一方面是由于膜蛋白显而易见的重要作用,但另一方面也是受限于细胞膜磷脂组装体的复杂性,导致常规表界面表征手段难以研究磷脂分子跨膜的不对称性。和频振动光谱,以二阶非线性光学过程为基础,具有本征的表界面选择性和超高的分子取向敏感性,可探测不同类型的表界面,已应用于各种表界面研究领域。和频光谱可实现实时、原位、无损、非标记、非真空检测,尤其适合以固/液界面为主要形式的生物表界面研究,且基于对称性破缺的和频信号产生机理,使之成为针对细胞膜界面磷脂跨膜不对称性的极为理想的表征手段。本论文应用和频光谱,在构建的多种仿生磷脂双层膜实验体系的基础上,深入研究了磷脂跨膜不对称性及其相关影响因素,其中涉及磷脂自身性质、离子环境、界面蛋白质分子等多方面。通过获取分子层面的静态结构和动力学信息,阐明了几种影响因素对磷脂跨膜不对称性的相应效应,揭示了潜在的分子作用机理,为细胞膜中磷脂跨膜不对称性的维持与调控,提供了重要的理论依据和应用借鉴。具体可分为:一、磷脂跨膜不对称性的不饱和度效应。细胞膜内外层磷脂分子的尾链不饱和度,具有天然的跨膜不对称性,但其存在和维持的机理尚未明确。选取多种头部相同而尾链不饱和度不同的磷脂分子,构建仿生磷脂双层膜体系,通过研究磷脂双层膜中,不同不饱和度的磷脂不对称性结构的动态变化与静态特征,发现了不饱和度高的磷脂分子不易跨膜翻转（有别于其易于横向扩散的特性）,表明了磷脂分子的高不饱和度有利于磷脂跨膜不对称性的形成与维持,同时揭示了其内在分子机制,为细胞膜中磷脂不饱和度分布差异的产生与维持提供了潜在解释,也为细胞磷脂组分调控和适应性脂质体构建等生物医学应用提供了理论指引。二、磷脂跨膜不对称性的离子尺寸效应。离子与细胞膜中磷脂分子的作用广泛存在,却未得到足够重视。选取性质相近、半径不同的同族金属阳离子,通过研究不同离子对磷脂分子跨膜翻转行为和跨膜不对称性的影响,发现了离子尺寸与磷脂分子间距的匹配效应。当两者匹配时,磷脂分子跨膜翻转受到阻碍,磷脂跨膜不对称性得到一定程度的维持;而当两者不匹配时,则会促进磷脂跨膜翻转过程,进一步破坏磷脂跨膜不对称性。这一发现,再次强调了细胞膜内的磷脂分子远超常规认知（仅作为被动的结构单元）的功能性,也为研究磷脂离子通道及其维持细胞离子稳态的工作机理提供了重要启示。三、磷脂跨膜不对称性的蛋白质结合效应。膜联蛋白A5结合细胞膜的形态结构十分复杂多样,对其分子动态变化的理解也有所欠缺。在构建仿生不对称磷脂双层膜的基础上,通过研究钙离子依赖的和钙离子非依赖的两种情况中,膜联蛋白A5对磷脂双层膜的多种结合状态,发现了膜联蛋白A5膜结合状态转换过程中的蛋白质取向重排现象,阐明了多种膜结合状态下膜联蛋白A5对磷脂双层膜的不同作用,以及对磷脂跨膜不对称性的维持。研究中揭示了通常易于忽略的钙离子非依赖的膜联蛋白A5的膜结合状态,以及鲜有研究的膜结合状态的转换过程,加深了对膜联蛋白结合细胞膜的分子机制的认知与理解,也为细胞膜结合蛋白对磷脂跨膜不对称性的影响提供了重要参考。四、磷脂跨膜不对称性的蛋白质变形效应。蛋白质分子在细胞膜界面的可控二级结构转变,对研究淀粉样蛋白聚集及其对细胞膜界面的影响具有重要意义。以溶菌酶分子为模型,在磷脂双层膜界面,借助三羧乙基膦分子,成功实现了对溶菌酶二级结构转换的可控诱导。通过研究磷脂双层膜界面上结构变形前后的溶菌酶分子,发现了其二级结构由α螺旋向反平行β折叠转换的过程,从分子层面揭示了结构变形前后溶菌酶的不同聚集状态（从分散到寡聚）及其对磷脂双层膜界面的不同作用形式（从静电到疏水）,明确了界面溶菌酶的结构变形对界面磷脂跨膜不对称性的影响。由此,提供了磷脂膜界面蛋白质淀粉样聚集的潜在途径与分子机制,也为细胞膜中磷脂跨膜不对称性的维持与调控做出了有益探索。综上所述,本论文以磷脂跨膜不对称性的维持与调控为切入点,利用先进的和频光谱技术,从分子静态结构和动力学变化等层面,深入研究了磷脂跨膜不对称性的几个重要影响因素及其相应效应,阐明了相关分子作用机理,加深了对细胞膜界面磷脂跨膜不对称性的认知,为磷脂跨膜不对称性的维持与调控提供了重要的理论依据和应用指引,一定程度上推动了和频振动光谱技术在生物表界面的应用发展。未来,随着这些发现在复杂生命体系中的不断验证与修正,其在生物医学领域的应用将迎来更加广泛的关注和更加长远的拓展。