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黑莓作为第三代新兴小浆果,不仅营养价值丰富而且经济价值高。近年来,中国黑莓产业不断发展,无论栽培面积还是产量都不断增长。伴随着真菌及病毒病等蔓延,以及范围日益扩大,造成了严重的损失。为使黑莓育种效率进一步提高,推动其育种进程,当代许多研究者加速了现代生物技术和基因工程技术的研究。目前,我国黑莓优良苗木的缺乏对黑莓种植业造成了一定程度的限制。基于组织培养具有育苗周期短,苗木整齐性统一,不受自然环境生长季节的限制等特点,本试验对组织培养进行黑莓快速繁殖的技术体系进行了初步研究。尤其是对黑莓外植体消毒、外植体的建立、增殖培养,生根培养、炼苗及移栽等生产环节进行了试验,同时结合育种工作需求,对叶片不定芽诱导及愈伤组织诱导几个环节进行了试验研究,并利用黑莓组培苗叶片进行了原生质体分离、纯化研究。主要试验结果如下:1、建立了黑莓‘Arapaho’基于组织培养快繁技术体系。(1)适宜黑莓‘Arapaho’茎尖及茎段消毒的方法:用70%酒精消毒10 sec,在无菌水中清洗3次,用0.1%的Hg Cl2消毒10 min,然后无菌水中清洗6次。(2)最适增殖培养基:以组织培养30 d左右的壮苗为材料,培养基配方为:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L,增值系数为4.98。(3)最适生根培养基:黑莓‘Arapaho’极易生根。在添加1 g/L的活性炭的1/2MS培养基中,黑莓‘Arapaho’的生根率达到93.33%;当IBA浓度达到5 mg/L时,黑莓‘Arapaho’的生根率可达到100%,而且会有侧根长出。(4)炼苗及移栽:选取生根良好,植株健壮的组培苗为材料,开盖炼苗一周左右进行移栽。移栽基质为泥炭土、珍珠岩与原土比例为6:3:1,成活率达100%。(5)最适叶片不定芽诱导培养基:继代培养30 d左右组培苗茎尖的幼嫩叶片为材料,叶片不定芽诱导培养基使用MS+TDZ 1.5 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6 g/L时不定芽再生率最高。低浓度TDZ仍然能诱导叶片不定芽再生,但TDZ浓度为0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 mg/L对叶片不定芽的再生率无显著差异。(6)最适愈伤组织诱导的培养基:继代培养30 d左右组培苗茎尖的幼嫩叶片为材料,细胞分裂素TDZ与低浓度生长素NAA组合能够诱导黑莓‘Arapaho’愈伤组织产生,愈伤组织诱导率可达100%。其中NAA 0.1 mg/L,TDZ 1 mg/L时愈伤组织多为疏松型,浅绿色愈伤或黄绿色愈伤,而且生长速度快。(7)在整个过程中,可以使用市售白砂糖为碳源替代物,自来水为蒸馏水替代物,与使用实验室分析纯蔗糖碳源与蒸馏水并无显著差异。2、建立了黑莓叶片原生质体分离纯化体系,获得了产量高,活力高的原生质体。以最优的体系获得的原生质体得率可达8.64×107个/g﹒FW,活力可达94.44%。(1)最佳酶解液组合是:2.5%的纤维素酶(Cellulase R-10)+0.03%的果胶酶(Pectolyase Y-23)+1%的离析酶(Macerozyme R-10)。(2)原生质体分离中在低速(80r/min左右)的恒温摇床上酶解9 h,可以获得较高产量和活力的原生质体。(3)当甘露醇作为渗透压调节剂时,适宜浓度为12%。浓度过高或过低都会影响原生质体产量和活力。(4)在原生质体分离前,将材料暗处理7d,能够提高原生质体产量。