猪瘟病毒(Hog cholera virus, HCV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起母猪繁殖障碍的4种主要病原体;引起种猪不育,即公猪睾丸肿胀,精液质量下降,失去种用能力;母猪表现为不发情,返情,不孕;妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等,给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。在动物流感中,猪流感是除禽流感以外经济意义最大,而且公共卫生意义特别重要。2009年墨西哥爆发的猪流感疫情导致数百人死亡,并且,猪流感引起的人类流感迅速在世界上传播开来。所以,猪流感的预防和控制密切关系到人类的公共卫生安全。目前,针对以上5种病毒病的诊断方法有很多,但这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点;虽然临床已经使用的PCR诊断技术,有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点,但会出现假阴性;而TaqMan荧光定量PCR方法能定量,但成本较高,且需要合成特异性探针。亟需研究开发成本低、简便、快速、特异、定量的检测方法。近年来这5种病多呈混合感染,为此,我们做了以下研究:(一)利用已报道的猪瘟病毒5,端保守序列、伪狂犬病毒的gH基因序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列,分别设一对引物,先通过常规PCR扩增,经克隆纯化后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒为模板建立了能够同时检测猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型三重SYBR Green定量PCR技术。通过对所建立的荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性分析发现,该方法能最少检测183拷贝猪瘟质粒、231拷贝猪伪狂犬病毒质粒和203拷贝猪圆环病毒2型质粒;不能检测出非特异的猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。试验表明:所建立的三重SYBR Green定量PCR技术能够有效检测和诊断这三种病毒,有利于这三种病毒混合感染的早期预防和治疗。(二)利用已报道的猪瘟病毒5,端保守序列、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因组序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列,分别设一对引物,先通过常规PCR扩增,经克隆纯化后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒为模板建立了能够同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型三重SYBR Green定量PCR技术。通过对所建立的荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性分析发现,该方法能最少检测177拷贝猪瘟病毒质粒、202拷贝猪繁殖与呼吸综合征病毒质粒和181拷贝猪圆环病毒2型质粒;不能检测出非特异的猪细小病毒、猪伪狂犬病毒。试验表明:所建立的三重SYBR Green定量PCR技术能够有效检测和诊断这三种病毒,有利于这三种病毒混合感染的早期预防和治疗。(三)利用已报道的猪瘟病毒5,端保守序列、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因组序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列、猪流感病毒H9亚型,分别设一对引物,先通过常规PCR扩增,经克隆纯化后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒为模板建立了能够同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪流感病毒四重SYBR Green定量PCR技术。通过对所建立的荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性分析发现,该方法能最少检测173拷贝猪瘟病毒质粒、196拷贝猪繁殖与呼吸综合征病毒质粒、203拷贝猪圆环病毒2型质粒和211拷贝猪流感病毒质粒;不能检测出非特异的猪细小病毒、猪伪狂犬病毒。试验表明:所建立的四重SYBR Green定量PCR技术能够有效检测和诊断这四种病毒,有利于这四种病毒混合感染的早期预防和治疗。