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第一部分临床分离肠球菌耐药性分析研究目的了解临床分离肠球菌耐药特征,给临床诊断和治疗肠球菌感染提供依据,为进一步开展肠球菌耐药机理和分型研究奠定基础。研究方法1菌株来源397例肠球菌全部分离自杭州市中医院2005年2月至2008年3月期间的住院患者,其中粪肠球菌339株,屎肠球菌58株。2药敏实验所有菌株均经生物梅里埃公司API鉴定板条鉴定。应用法国生物梅里埃公司VITEK 2全自动细菌分析仪配套试剂进行药物敏感试验。以粪肠球菌ATCC29212为质控菌。研究结果药敏试验表明,肠球菌已成为医院感染重要的耐药菌,397株肠球菌属临床分离株中,粪肠球菌和屎肠球菌对11种抗菌药物具有不同的耐药谱。除对万古霉素外,两种肠球菌耐药情况较为严重,屎肠球菌对氯霉素、氨苄西林、四环素的敏感率为89.66％、46.55％、39.66%,而粪肠球菌为73.82％、46.31％、39.35%。对万古霉素耐药率较低,分别为7.72％、7.94%。从MIC的分布情况来看,90%粪肠球菌和91%屎肠球菌对万古霉素的MIC≤4μg/ml.结论屎肠球菌和粪肠球菌耐药情况较为严重,屎肠球菌对氯霉素、氨苄西林、四环素的敏感率较高,而粪肠球菌敏感率较低。屎肠球菌和粪肠球菌对万古霉素耐药率均较低。第二部分临床分离肠球菌毒力基因及多位点序列分型研究研究目的比较杭州地区万古霉素敏感屎肠球菌(vancomycin susceptible Enterococcus faecium, VSEF)和万古霉素耐药屎肠球菌(vancomycin resistant Enterococcus faecium, VREF)分离菌株的遗传背景、耐药机理和分子分型。研究方法1.菌株来源收集2008年5月至2009年8月期间临床分离万古霉素耐药屎肠球菌(VREF)19株,来自杭州地区三家医院；收集2008年10月至2009年10月期间浙江大学医学院附属第一医院临床分离万古霉素敏感屎肠球菌(VSEF)21株,作为对照菌株。以粪肠球菌ATCC29212为质控菌。2.药敏实验按照NCCLS推荐的K-B法或E-test法检测21株VSEF和19株VREF对利奈唑胺(LZD)、万古霉素(VAN)、替考拉宁(TEC)、奎奴普丁/达福普汀(QD)、利福平(RD)、替加环素(TGC)、磷霉素(FOS)、氨苄西林(AM)的敏感性；3.毒力基因检测采用PCR方法检测所收集到的21株VSEF和19株VREF的常见毒力基因asal、gel、cyt、hyln、esp,了解并比较各基因出现的频率及分布特征；4.多序列位点分型采用多位点序列分型(MLST)技术测定21株VSEF和19株VREF菌株7种管家基因atp、ddl、gdh、purk、gyd、psts、adk的基因序列,将其结果按MLST方法进行分类,与相应数据库进行比较,获得杭州地区菌株的序列型(ST),并将VSEF与VREF的序列型(ST)进行比较。研究结果1．19株临床分离的VREF多重耐药情况严重,对糖肽类抗生素万古霉素MIC均≥256μg/ml,替考拉宁MIC均≥24μg/ml,所有菌株对阿米卡星、氨苄西林耐药,对庆大霉素高水平耐药,但所有VREF菌株对利奈唑胺和替加环素敏感。21株临床分离的VSEF菌株耐药情况较轻,所有21株VSEF菌株对替考拉宁、利奈唑胺和替加环素敏感,1株VSEF菌株对奎奴普丁/达福普汀耐药,3株VSEF菌株对磷霉素耐药。2.毒力基因检测结果显示,21株万古霉素敏感屎肠球菌(VSEF)中有15株检出毒力基因,阳性率为76.20%,不同毒力基因阳性率由高至低依次为esp (76.20%)、hyln(4.76%),其余3种毒力基因皆未检出。19株万古霉素耐药屎肠球菌(VREF)中有13株检出毒力基因,阳性率为68.42%,不同毒力基因阳性率由高至低依次为esp (68.42%)、hyln(10.52%), asal、gel、cyt毒力基因各有一株阳性,阳性率皆为5.30%.从以上数据可以看出,此次检测的万古霉素耐药及敏感屎肠球菌在毒力基因表达方面无明显差异。近年来,肠球菌毒力基因或潜在的毒力基因在肠球菌中的分布研究较多,不同来源、不同种肠球菌毒力基因检出率存在较大差异,可能是地区、人群、标本等构成不同而造成的。3.19株VREF分离株总共分为6个ST型,其中12株等位基因谱相同,为ST78型；ST203型、ST341型各2株,其它3株菌分属3个不同的ST型；21株VSEF分离株总共可以分为14个ST型,其中5株菌序列型相同,为ST78型,其余16株菌分属于13个不同的ST型。比较以上两类屎肠球菌ST型,我们发现有两个ST型,即ST78和ST203型在两类屎肠球菌中均有出现。VREF和VSEF中ST78型分别出现12株与5株,各占63.2%与23.8%。从中我们可以看出,在VREF中ST78序列型占有明显的优势,是优势型别。对于VREF菌株,采用eBURST软件分析后,发现ST78、ST341、ST18等15株菌为同一组分型,属于克隆复合体CC17。而在VSEF中,共出现14个型别,5株为ST78型,占23.8%。本次实验共40株屎肠球菌,共检出ST78型19株,占47.5%，其余的序列型仅散在分布,散在分布在17个序列型中。因此可以看出,ST78型菌株分布最为广泛,来源于不同的临床标本类型,尤其是杭州地区VREF的优势克隆,是否是我国VREF的优势克隆,需扩大样本量进一步研究。而VSEF分离株存在广泛的遗传多样性,多数菌株亲缘关系较远。结论VREF与VSEF在携带毒力基因方面无明显差异,阳性率最高的是esp。ST78是杭州地区VREF的优势克隆,而VSEF分离株存在广泛的遗传多样性。