背景与目的骨髓间充质干细胞（BMSCs）是存在于骨髓中的一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞。研究表明骨髓间充质干细胞可以向内胚层、中胚层和外胚层组织细胞分化，如肝细胞、心肌细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪细胞和胰岛素分泌细胞等。本研究旨在体外分离培养大鼠BMSCs，观察BMSCs的生物学特性，并采用流式细胞检测技术鉴定BMSCs。为进一步观察体外BMSCs向胰岛素分泌细胞分化奠定基础。材料与方法Wister大鼠麻醉致死后，无菌条件下取出胫骨和股骨用L-DMEM培养基从骨腔一端冲洗骨髓腔，冲出骨髓，轻柔充分吹打成单细胞悬液，离心洗涤后，所得细胞按1×10⁸/mL密度接种于25cm²塑料培养瓶中，37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养48小时，首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后每2-3天换液1次，观察细胞形态变化。待细胞生长良好，80％融合后，传代培养。取第3或4代细胞做流式细胞检测，检测获得的贴壁细胞表面标记抗原CD29、CD90和CD45表达情况。结果在最初培养的48h内，可见大量圆形细胞，悬浮生长。48h后可见部分细胞呈贴壁生长。至第5天时，随着换液次数的增加，圆形悬浮细胞逐渐减少，贴壁细胞明显增多，呈聚集样生长，细胞形态呈梭形和多角形。约10-14天后细胞铺满瓶底，呈鱼丛状或漩涡状聚集，细胞形态呈梭形。流式细胞方法检测大鼠BMSCs的表面标记抗原。结果显示：第三代大鼠BMSCs的特异性表面标志物：CD29阳性，阳性率为91．9％；CD45阴性，阳性率为6．9％；CD29/CD45阳性率为7．4％；CD90阳性，阳性率为51．3％；CD90/CD45阳性率为3．6％。结论本实验通过贴壁筛选法和全骨髓培养法成功分离培养了大鼠骨髓间充质干细胞。目的探讨联合应用高糖和GLP-1、活化素A、尼克酰胺和β细胞调节素刺激体外能否诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化。材料与方法体外培养人骨髓间充质干细胞，待细胞80％融合时，用0．1％胰蛋白酶消化传代，按2×10⁵/ml接种于96孔板。观察细胞生长情况。采用以下诱导刺激方案：先给予23mmol/L高葡萄糖刺激约20天，接着再将刺激后细胞分为7组，分别给予不同的刺激条件：A组：23mmol/L高葡萄糖培养基刺激；B组：L—DMEM培养基中加GLP-1，终浓度为5nmol/L；C组：L—DMEM培养基中加活化素A，终浓度为10ng/ml；D组：L—DMEM培养基中加尼克酰胺，终浓度为10mmol/L；E组：L—DMEM培养基中加GLP-1+活化素A+尼克酰胺+BTC刺激因子协同作用；F组：L—DMEM培养基中加β细胞调节素，终浓度为10ng/ml；G组为普通L—DMEM培养基，设为对照组。在不同的刺激条件下，培养细胞16天，每2～3天更换细胞培养液1次，待细胞铺满瓶底，80％融合时传代，制备细胞爬片。用放射免疫法检测细胞培养基中的胰岛素水平。RT-PCR检测各刺激组细胞胰岛素mRNA的表达水平。免疫细胞化学方法检测各刺激组细胞胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和巢蛋白的表达。检测诱导分化后细胞对高葡萄糖刺激的胰岛素释放实验。将诱导分化后细胞按3×10⁵/孔密度接种于24孔培养板中，37℃培养过夜。第二天，收集旧的培养基后，PBS洗涤细胞3次，新鲜L-DMEM1ml，培养1小时，再给予23mmol/L高葡萄糖培养基刺激细胞2小时，分别于0分、30分、1h、2h收集培养基，放射免疫法检测胰岛素分泌水平。胰蛋白酶消化、收集细胞后，将收集的细胞加入酸酒精中，-20℃过夜，次日用细胞超声破碎仪破碎细胞，取上清检测胰岛素浓度。考马斯亮兰法测定细胞内总蛋白浓度。结果1．诱导分化前hBMSCs呈贴壁生长，细胞透明，呈梭形或多边形，鱼丛状或漩涡状聚集生长。未给予任何刺激前人骨髓间充质干细胞培养基中（细胞密度为1．0×10⁶/m1）胰岛素水平为2．2867±0．2665μU/ml。放射免疫法检测普通L-DMEM培养基中胰岛素水平为2．3650±0．4296μU/ml（空白对照，本底值）。该两组间的T检验，P值为0．359＞0．05，两组间胰岛素水平无显著性差异。2．给予23mmol/L高葡萄糖刺激刺激20天，再将上述步骤得到的细胞分为不同的7个刺激组，16天后收集细胞培养基，检测胰岛素分泌水平，发现23mmot/L高糖组、GLP-1组、活化素A组、尼克酰胺组、协同作用组、BTC组和普通L-DMEM组胰岛素分泌水平与刺激前hBMSCs细胞培养基（胰岛素分泌量为2．2867±0．2665μU/10⁶ cells和/ml）相比，分别增加了3．13、3．00、2．35、2．94、2．84、3．22和2．32倍。协同作用并没有显著增加胰岛素分泌量。3．RT-PCR检测胰岛素mRNA水平发现：GLP-1组和活化素A组可见清晰的胰岛素PCR产物目的片段。协同作用组和BTC组分别在900bp和300bp位置见到特异性条带，而且900bp片段较300bp片段清晰。900bp的未知片段经测序后，发现其与人胰岛素原基因相比较有较多的突变，故未能证实该未知片段的性质。尼克酰胺组隐约可见300bp胰岛素目的片段，但条带亮度太低。高糖组和普通L-DMEM组均未见到胰岛素目的片段。4．免疫细胞化学证实除了高糖+普通L-DMEM培养基外，各刺激组均有胰岛素表达；各刺激组均未表达胰高血糖素；除协同作用组有生长抑素的弱阳性表达外，其它各刺激组均未表达生长抑素；尼克酰胺组和协同作用组可见到巢蛋白的弱阳性表达，其余各刺激组均未表达巢蛋白。5．高糖刺激胰岛素释放实验结果示，经联合高糖和GLP-1、活化素A、BTC、尼克酰胺和共同刺激诱导分化后，BMSCs对高葡萄糖刺激有反应，能相应增加胰岛素的分泌量；6．细胞内胰岛素浓度以活化素A组、BTC组和高糖+普通L-DMEM组最高，其它各刺激组细胞内胰岛素浓度较低。结论本实验应用高糖和GLP-1、活化素A、尼克酰胺、BTC等刺激因子分别或联合于体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化，经放射免疫方法、RT-PCR、免疫细胞化学等方法证实，高糖、GLP-1、活化素A、尼克酰胺和BTC均可以在体外诱导人BMSCs分化为胰岛素分泌细胞，但胰岛素表达量或产生量仍较低。本实验未发现各刺激条件间有较强的协同作用。