论文部分内容阅读
研究背景众所周知,各种慢性肝病可由肝纤维化发展为肝硬化,门静脉高压是肝硬化的严重并发症。肝硬化状态下,肝内血管阻力的增加是导致门静脉高压的重要因素。肝呈状细胞（hepatic stellate cells,HSC）是肝纤维化细胞外基质的主要细胞,HSC活化在肝纤维化的发生发展以及门脉高压形成一系列过程中起关键作用。活化的HSC转化为肌成纤维细胞和成纤维细胞,不断增殖,并获得收缩性。当HSC发生强烈收缩,致使肝窦直径缩小,肝内血管阻力增大;同时可引起肝组织瘢痕挛缩,进一步增加肝内血管阻力,导致门静脉高压。可见,HSC收缩的调控机制是门静脉高压机理研究的重要一环。近年来,肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）已成为肝纤维化研究领域的热点,血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）是RAAS的重要效应分子,可诱导HSC的活化和增殖而促进肝纤维化的形成,肝内ACE-AngⅡ-AT1R轴与门静脉高压的形成有密切的关系。研究还表明合成醛固酮（AIdosterone,AIdo）也具有和AngⅡ似的作用。然而目前有关AngⅡ和AIdo诱导HSC收缩的机制的研究较为鲜见,其作用机制尚不明确。HSC活化后转化为肌成纤维细胞样细胞,具有平滑肌细胞的特征,提示HSC收缩和平滑肌细胞收缩的分子机制是类似的,可通过钙离子依赖性和非钙离子依赖性两种通路完成收缩。在非钙途径中,RhoA-Rock通路对HSC收缩的调控机制是近年研究的热点。本研究通过观察AngⅡ和AIdo对HSC收缩及RhoA-Rock信号通路上各元件表达的影响来阐明其对HSC收缩机制的影响。目的探讨血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）和醛固酮（Aldosterone,Aldo）对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）收缩以及由Rho激酶介导的非Ca2+依赖性信号转导通路的影响。方法采用HSC-T6细胞株,给予AngⅡ和Aldo 1μmol/L处理,聚硅酮膜法直观检测HSC的收缩性;激光共聚焦显微镜下动态观察HSC胞内游离钙离子浓度变化;另予AngⅡ和Aldo 10μmol/L处理,免疫印迹法检测肌球蛋白轻链（myosin lightchain.MLC）和磷酸化MLC表达水平。观察AngⅡ1型受体（AT-1受体）阻断剂伊贝沙坦（irbesartan）、Aldo受体阻断剂安体舒通（antisterone）、PKC（Protein kinaseC）特异性抑制剂Stauro、Rho激酶特异性抑制剂Y27632、MLCK（myosin lightchain kinase,MLCK）特异性抑制剂ML-7对磷酸化MLC表达水平的影响;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Rho-Rock通路中Rock2（Rho kinase2）、RhoAGTP、RhoGEF（Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors,RhoGEF）及PKCmRNA的表达。结果AngⅡ和Aldo均可诱导HSC的收缩;AngⅡ可促进HSC胞内游离钙离子浓度增加,而Aldo对HSC胞内游离钙离子浓度变化无显著性影响。AngⅡ和Aldo均可诱导磷酸化MLC蛋白水平的变化,并呈时间依赖性,均在刺激15min达到峰值后逐渐减低。AngⅡ+Irbesartan和AngⅡ+Y27632处理组可抑制AngⅡ诱导的MLC蛋白磷酸化水。而AngⅡ+ML-7+Stauro联合处理组磷酸化MLC蛋白水平显著高于AngⅡ+Y27632处理组（P=0.003）。AngⅡ+Y27632+ML-7+Stauro四者联合作用可使磷酸化MLC蛋白水平显著降低,差异有统计学意义（P=0.000）。Aldo处理组磷酸化MLC蛋白的表达水平显著高于对照组（P=0.001）;安体舒通和Y27632可抑制Aldo诱导的MLC蛋白磷酸化水平;Aldo+ML-7+Staur联合处理组磷酸化MLC蛋白水平显著低于Aldo+Y27632处理组（P=0.022）。Aldo+Y27632+ML-7+Stauro三者联合作用可使磷酸化MLC蛋白水平显著降低,与Aldo处理组相比差异有统计学意义（P=0.001）。AngⅡ处理组Rock2、RhoAGTP、RhoGEF mRNA的表达显著增强,AngⅡ+Irbesartan处理组三种元件的表达显著减弱。AngⅡ+Y27632处理组Rock2与RhoGEF mRNA的表达减弱,RhoAGTP的表达增强。ML-7和Stauro联合抑制组以及Y27632、ML-7和Stauro三种阻断剂联合抑制组,三种元件的表达均增强。Aldo组Rock2、RhoAGTP、RhoGEF和PKC mRNA的表达显著增强,而其阻断剂安体舒通可明显抑制这四种元件mRNA的表达。Aldo+Y27632组上述四种元件mRNA的表达较Aldo组减弱。Aldo+ML-7+Stauro联合组断后四种元件的mRNA表达较对照组增强,Y27632、ML-7和Stauro三者同时抑制组,RhoGEF的表达较ML-7+Stauro联合抑制组增强,PKC mRNA的表达减弱。结论AngⅡ和Aldo均可诱导HSC的收缩;AngⅡ可促进HSC胞内游离钙离子浓度增加,Aldo对HSC胞内游离钙离子浓度变化无显著性影响。AngⅡ主要通过RhoA-Rock信号通路诱导HSC的收缩;Aldo可通过RhoA-Rock信号通路诱导HSC的收缩。