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乌头类中药属于毛茛科植物,在我国使用已有2000多年的历史。其植物主根为乌头,侧根为附子,独根为天雄,均可入药,是临床常用的祛风散寒、除痹止痛之品。其中附子有回阳救逆之功效,在现代医学中常用于救治急性心肌梗塞所致的休克、低血压状态、冠心病、风心病和多种疑难疾病,在救治冠心病、风心病和低血压等方面均表现出良好的治疗效果,乌头类生物碱为其有毒的成分。因此,乌头的显著疗效与毒性作用并存。其毒性主要表现为中枢神经系统和心血管系统,而对心脏的毒性最为明显。可出现多形性心律失常,如单源室性早搏、单源多形室性早搏、室速及室颤,病人常因心律失常及呼吸中枢麻痹死亡。对乌头中毒患者的血液学分析表明,其主要毒性成分为乌头碱(ACO)、新乌头碱(MACO)等。ACO是目前常用的制备心律失常的工具药,常用于抗心律失常药物的机制研究。MACO是ACO的结构类似物,共同拥有C19母核结构,但其是否具有致心律失常的毒性作用尚未见报道,对其作用机制更是鲜有研究。心肌细胞动作电位的产生是细胞膜多种离子通道共同作用的结果,细胞膜离子转运失衡可导致心律失常的发生。一般认为,ACO的致心律失常作用和其促进钠离子内流,使细胞内钠离子浓度([Na+]i)增加,通过生电性的钠钙交换体(Na+/Ca2+exchanger)使细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)增加,导致细胞内钙超载有关。此外,近年来的研究发现ACO对L-型钙通道、HERG和Ikur通道也有不同程度的抑制作用。ACO对以上离子通道共同作用的结果,可能使APD延长,进而出现迟后除极(DAD)和触发活动(TA)。然而,研究发现,ACO在细胞外液低钙条件下,可缩短APD并诱发DAD和TA。由此可以认为,ACO诱发的心律失常和APD的改变有关,APD延长或缩短可能和所选用的细胞外液及动物种属有关。采用细胞内微电极技术,在豚鼠乳头肌的动作电位记录中,我们也发现,ACO可通过缩短APD诱发DAD的产生,而这一点不能单纯用Na+电流兴奋来解释。Na+/K+泵可通过消耗ATP,将动作电位期间细胞内过多的Na+泵出细胞外,维持细胞静息膜电位的稳定,并保持细胞的兴奋性。ACO对中枢的Na+/K+泵有明显的抑制作用,但其对心脏的Na+/K+泵是否有抑制作用尚未见报道。综合以上所述,ACO所致的心律失常不能单纯用促进Na+电流或抑制Ca2+及K+电流来解释,MACO是否具有致心律失常作用及其致心律失常的机制尚未见报道。因此,在本次研究中我们拟采用整体动物模型,观察并比较ACO和MACO的致心律失常作用,并在细胞和离子通道水平对其致心律失常的机制进行分析。该研究可丰富ACO和MACO的致心律失常理论,为临床避免和降低其毒副作用提供理论基础;另外,还可以为药理实验中选择心律失常模型提供实验证据。第一部分ACO和MACO对豚鼠心电图的影响目的:观察ACO和MACO对豚鼠整体心电图的影响,并对二者出现的心律失常类型及严重程度进行对比分析。方法:选取体重在300-350g的雄性健康豚鼠25只,随机分为溶剂对照组(5只)、ACO25μg/Kg组(10只)和MACO25μg/Kg组(10只)。将豚鼠称重,用1.2%的戊巴比妥钠(0.3ml/100g)麻醉后固定。实验组动物分别股静脉注射ACO或MACO,注射剂量均为25μg/Kg,对照组静脉给予等容积的生理盐水。用RM6240CD型多道生理信号采集处理系统记录各组实验动物给药前后ECG的变化,最长记录120min。结果:对照组动物连续记录120min,心电图未见明显异常。ACO组给药前及给药后20min内豚鼠的心电图未见明显异常,在22.75±5.70min时出现室性早搏(8/10),在27.75±13.0min时发生房室传导阻滞(5/10),在42.30±15.69min时发生室性心动过速(5/10),在39.65±7.17min时发生室颤(3/10),在56.32±11.40时有40%动物死亡。MACO组动物在给药后1.46±0.66min时即发生室性早搏(9/10),在1.46±0.66min时发生房室传导阻滞(7/10),2.53±0.87min时发生室性心动过速(9/10),在3.51±1.19min时发生室颤(9/10),在23.1±14.92min时动物全部死亡。MACO组豚鼠发生室性早搏、房室传导阻滞、室性心动过速及室颤的时间均明显早于ACO组(P均<0.05),且室颤及死亡发生率明显高于ACO组(P均<0.05)。结论:ACO和MACO均可使豚鼠诱发心律失常,且其二者诱发心律失常的类型基本相同。在同等剂量下,MACO诱发的心律失常发生时间明显早于ACO及动物死亡率高于ACO。第二部分ACO和MACO对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响和机制分析目的:观察ACO和MACO对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响,并分析其作用机制。方法:急性分离豚鼠心室肌细胞,采用全细胞穿孔膜片钳技术,在电流钳的模式下记录:(1)ACO和MACO对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响。(2)在非特异性和特异性Na+/K+泵抑制剂偏钒酸钠(SMV)、哇巴因(OUA)存在的条件下,记录ACO和MACO对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响。(3)在特异性Na+通道抑制剂河豚毒素(TTX)存在的条件下,观察ACO和MACO对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响。结果:(1)10-7M ACO对AP的各项参数均未见明显影响。ACO3×10-7M和3×10-6M均能缩短APD30和APD690。此外,3×10-M尚可使RMP和APA明显减小,并出现DAD和TA。而MACO10-7M和3×10-7M亦能缩短APD30和APD。此外,3×10-790M尚可使RMP和APA明显减小,并出现EAD、DAD和TA。(2)在SMV(10-3M)存在的情况下,ACO (3×10-7M)对APD30和APD90未见明显缩短作用,但对高浓度的ACO(3×10-6M)所致的DAD和TA无明显影响;另外,SMV(10-3M)消除了高浓度的ACO(3×10-6M)对RMP, APA的影响。SMV(10-3M)不能够抑制MACO对APD30,APD90的影响,但能够消除的高浓度的MACO(3×10-7M)对RMP, APA的影响,对DAD,EAD,TA的发生无明显影响。OUA(10-7M)能够明显缩短APD30,APD90,抑制低浓度ACO(3×10-7M)缩短APD30,APD90的作用,消除高浓度的ACO(3×10-6M)对RMP, APA的影响,对DAD和TA的发生无明显影响。OUA仅能够消除高浓度的MACO(3×10-7M)对RMP, APA的影响。(3)TTX(2×10-6M)能使RMP水平明显下移,对动作电位其它参数无明显影响;在TTX存在的条件下,高浓度的ACO(3×10-6M)仅能够使APD30,APD90明显缩短,但无DAD, TA发生,低浓度ACO对动作电位的作用被完全消除。低浓度的MACO(10-7M)对动作电位的作用被完全消除,高浓度的MACO(3×10-7M)能够明显缩短APD30,APD90,但仅能诱发出EAD且发生率明显降低。结论:1.ACO和MACO均可通过缩短APD诱发DAD和TA,MACO尚诱发EAD;在同一浓度下,MACO较ACO更容易诱发心肌细胞的电生理活动异常。2. ACO可通过抑制Na+/K+泵及兴奋Na+通道电流而影响动作电位,而MACO主要通过兴奋Na+通道电流而影响动作电位。第三部分ACO和MACO对豚鼠心肌细胞Na+/K+泵电流(INa/K)和Na+通道电流的影响(INa)目的:研究ACO和MACO对豚鼠心肌细胞INa/K和INa的影响。方法:利用全细胞膜片钳技术,通过负压吸破细胞膜的方法建立全细胞记录,在电压钳模式下:(1)鉴定INa/K的电生理学特征。(2)分别记录ACO和MACO对INa/K的影响。(3)分别记录ACO和MACO对INa的影响。结果:(1)在我们的实验条件下记录出的INa/K符合豚鼠心室肌细胞INa/K的电生理学特征。(2)ACO能够浓度依赖性的抑制INa/K,ACO(3×10-7M)可抑制INa/K26.8±4.46%,ACO(3×10-6M)可抑制INa/K48.6±14.6%;MACO能够浓度依赖性的抑制INa/K, MACO(10-7M)可抑制INa/K28.0±7.5%,MACO(3×10-7M)可抑制INa/K41.8±9.3%。相同浓度下,MACO对INa/K的抑制作用强于ACO(P <0.05)。(3)ACO能够浓度依赖性的激动INa,低浓度的ACO(3×10-7M)能使INa增加25.5±9.2%,高浓度的ACO(3×10-6M)能使INa增加37.2±9.5%;MACO能够浓度依赖性的激动INa,低浓度的MACO(10-7M)能使INa增加13.0±1.9%,高浓度的MACO(3×10-7M)能使INa增加26.1±5.3%。相同浓度下,MACO对INa的兴奋作用和ACO相当(P>0.05)。结论:ACO和MACO均能浓度依赖性的抑制INa/K,激动INa。相同浓度下,MACO对INa/K的抑制作用强于ACO,而对INa的增强作用和ACO相当。