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前言肠三叶因子3 (Trefoil Factor 3, TFF3)是三叶因子家族的成员,广泛表达于哺乳动物的多种组织,对粘膜上皮有保护和修复作用,是一种调节性小肽。有研究表明,在炎症、癌症等病理状态下,TFF3的表达上调。TFF3除了作为一种粘膜保护肽,对上皮组织起到修复损伤作用外,近期发现它参与包括NF-κB等信号通路的调节。核因子κB (Nuclear Factor-kappa B, NF-κB),作为核转录因子,介导环境刺激,也做为一种关键的信号中枢调节多种病理、生理反应。研究表明NFκB参与调节多种涉及固有免疫和适应性免疫相关的细胞因子、生长因子和酶效应子的表达,包括T细胞受体、B细胞受体、TNFR、CD40、BAFFR、LTβR以及Toll/IL-IR家族成员。体内外的多种刺激通过不同的受体、受体近端分子、接头蛋白(如TRAFs、RIPs)等分子的介导,激活上游激酶复合物IKKs,从而引起抑止子IκBs的磷酸化、降解,释放出游离的NF-κB调节一系列靶基因的表达。不同的刺激因素可能以刺激特异性方式诱导IKKs复合物的激活,活化NF-κB通路。TFF3调节的NF-κB信号通路分子可能成为治疗免疫炎症相关疾病的新靶点,因此,明确TFF3激活NF-κB信号途径的分子机制具有非常重要的理论和临床意义。本研究报道了TFF3可能调节的NF-κB上游IκB激酶复合物亚基分子的变化,为明确TFF3激活NF-κB转导通路的调节机制提供了新的依据。材料与方法1. pGEX-5x-1-IKKβ载体构建及原核表达、纯化以M6P8载体为模板,PCR获得IKKβ片段。用T4 DNA连接酶,在4℃下进行酶切后的DNA片段和载体的连接反应。连接产物被转化至DH5α菌株中培养过夜。挑取单克隆,提取质粒、酶切鉴定,并测序。将重组质粒转化至BL21细菌中,培养过夜,第二天以1：100接种至200 ml LB,培养至OD600值至0.6-1.0,提取细菌蛋白,并纯化。2. pEGFP-TFF3重组载体的构建提取细胞RNA后RT-PCR获得hTFF3片段,酶切后连接至pEGFP载体中,酶切、测序鉴定。3.TFF3诱导下对IKKβ的表达调节作用转染pEGFP-TFF3载体,以RT-PCR.Western Blot检测IKKβ在TFF3诱导前后的表达变化。结果1.IKKβ蛋白在原核细胞中的表达纯化SDS-PAGE凝胶电泳检测IPTG诱导E.coli BL21蛋白表达,在73kD处纯化得到融合蛋白条带,与预期的蛋白分子量一致。2. pEGFP-C1-TFF3. pGEX-5x-1一IKKβ重组载体的构建及鉴定构建了pEGFP-C1-TFF3.pGEX-5x-1一IKKβ重组载体,经双酶切、测序结果显示酶切结果与预期片段分子量一致,测序结果与GenBank中TFF3. IKKβ的基因序列一致,证实载体构建成功。3.TFF3调节工KKβ分子在转录和翻译水平的表达发现IKKβ分子在转录和翻译水平均的表达受TFF3调节。结论TFF3调节IκB激酶亚基分子IKKβ的表达,提示IKKβ分子参与TFF3激活的NF-κB信号通路的调节,结果为TFF3在激活NF-κB中的作用提供了新的线索。本实验构建了pEGFP-C1-TFF3及pGEX-5x-1一IKKβ重组载体,并在原核细胞内实现了IKKβ分子的表达和纯化,为TFF3激活的NF-κB通路研究奠定了前期基础。