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硫氧还蛋白(Thioredoxin)是维护细胞氧化还原稳态(redox homeostasis)的重要成分。硫氧还蛋白结合蛋白(Thioredoxin interacting protein,TXNIP)是Thioredoxin的一个内源性的抑制因子,通过共价结合Thioredoxin的活性半胱氨酸抑制其抗氧化的功能,参与细胞增殖、凋亡等生物学过程。TXNIP是一个重要的肿瘤抑制基因,在多种肿瘤中表达下调,在肿瘤的发生发展和转移过程中发挥了非常重要的作用。TXNIP敲除小鼠出现肝癌、葡萄糖和脂类物质代谢紊乱症等多种疾病。TXNIP被报道可以被许多外界压力所诱导表达,比如H2O2、UV、IR辐射、热激、血清饥饿、高糖和一些细胞生长的抑制性因子如TGF-beta等。但是TXNIP蛋白是否在翻译后修饰水平受到的调控,仍然不清楚。 我们发现TXNIP蛋白的稳定性是受到泛素-蛋白酶体途径的调。在用蛋白酶体抑制剂MG132或lactacystin处理U2OS和H1299细胞后,TXNIP mRNA水平保持不变,但蛋白迅速变稳定。在细胞内,TXNIP蛋白可以被多聚泛素化修饰,蛋白酶体抑制剂处理可导致TXNIP泛素化条带的积累。为了鉴定在细胞内特异性行使泛素化修饰TXNIP的泛素E3连接酶,我们通过比对不同物种中TXNIP的蛋白序列,发现在TXNlP蛋白的C端具有两个保守的PPXY motif,提示TXNIP可能和一类Nedd4家族的泛素E3连接酶存在功能联系。为此,我们筛选了一组Nedd4家族的E3泛素连接酶,发现只有ltch能有效地降低TXNIP蛋白的稳定性。ltch被报道调控了许多重要蛋白如C-Jun、 p73、C-Flip的蛋白稳定性。我们发现ltch降解TXNlP的作用依赖于其泛素E3连接酶的活性,同时这种降解作用可以被蛋白酶体抑制剂MG132所阻断。TXNIP能显著降低TXNIP蛋白的半衰期。超表达ltch能降低内源TXNIP蛋白水平,而用siRNA削减ltch则能上调TXNIP蛋白水平。 我们发现ltch和TXNIP可以在内源和内源条件下相互作用,两者可在细胞质内共定位。我们进一步鉴定了两者相互作用的结构域,TXNIP的第二个保守的PPXY motif和ltch的WW结构域是两者体外相互作用所必须的。但ltch对TXNIP的有效降解则必须要有两个PPXY motif均存在。ltch能够在体内和体外条件下泛素化修饰ltch,并且这种作用依赖于其E3泛素连接酶的活性。 由于TXNIP参与了细胞内的ROS水平的调节,我们检测了ltch对细胞内ROS水平的影响。削减细胞内ltch的表达能显著调高细胞内的ROS水平,并且这种作用部分是依赖于上调TXNIP蛋白水平实现的。最后我们发现削减细胞内ltch能促进化疗药物Etoposide介导的细胞ROS水平的上升和细胞凋亡。 我们的发现将有助于深入理解TXNIP和ltch蛋白在肿瘤和代谢疾病的作用。