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牛奶是常见食物致敏原之一,在婴儿及儿童中可引起严重过敏反应。目前,食物过敏尚无有效疗法,预防牛奶过敏的唯一手段是避免接触牛奶致敏原。因此,迫切需要建立快速,灵敏,特异的牛奶致敏原检测方法,为食品致敏原的标识提供支持保障。论文针对牛奶主要致敏原:??-乳球蛋白,?-乳白蛋白及酪蛋白分别在DNA及蛋白水平建立了三种快速、灵敏、特异的检测方法,用于加工食品中牛奶致敏原的检测。1、根据NCBI上已公布的牛?-乳球蛋白的核酸序列设计一对特异性引物和探针,构建质粒标品,建立了食品中?-乳球蛋白的荧光定量PCR分析体系。检测灵敏度高(318copies);特异性强,对羊奶,豆浆DNA均无扩增反应;稳定性好,组内、组间的变异系数均在5%以内;对6种食品牛奶致敏原的检测结果与标签相符。基于DNA杂交原理进一步利用PCR验证的探针,构建了?-乳球蛋白DNA传感器。在金电极表面电沉积金纳米并固定探针,应用电化学阻抗图谱定量测定目标基因。经条件优化(探针浓度、固定时间,杂交温度、时间)对合成互补DNA检测限达到2.5×10-13 mol/L(S/N=3)。相比荧光定量PCR方法 DNA传感器操作简单,成本较低,对加工食品中?-乳球蛋白的PCR产物检测取得较好结果。2、根据NCBI上已公布的?-乳白蛋白核酸序列设计特异性引物及Taqman探针进行PCR扩增,构建质粒标品,建立拷贝数-循环阈值标准曲线。成功克隆?-乳白蛋白目的基因,建立的标准曲线在1.12×103-1.12×108 copies范围内线性关系良好。同时利用PCR验证的探针,构建了?-乳白蛋白DNA传感器。通过滴凃碳纳米管,电沉积金纳米修饰DNA传感器,以亚甲基蓝为杂交指示剂,优化了电沉积时间及亚甲基蓝吸附时间。用差分脉冲伏安法实现了目标基因的灵敏检测,对合成互补DNA检测限达到1.7×10-16mol/L(S/N=3),较?-乳球蛋白DNA传感器灵敏度有了较大的提高。3、基于四级杆串联质谱建立了在肽水平上同时检测?-乳球蛋白、?-乳白蛋白、酪蛋白的LC-MRM/MS方法。首先利用对三种蛋白酶解后的肽段进行质谱分析,选择既稳定又灵敏的肽段作为标签肽并设计合成内标肽,建立肽段的LC-MRM/MS定量方法,通过肽段表征对应蛋白的量。方法学验证结果显示三个蛋白检测限分别为:0.2、0.39、0.2?g/m L,质控样品的精密度,准确度及稳定性偏差均在15%以内,符合生物样品测定要求。最后将该方法用于加工食品中牛奶主要致敏蛋白的检测,标示含有牛奶的食品均在设定的MRM条件下出峰,无干扰信号,作为基质的小麦粉及阴性样品则无信号峰出现,呈较好的检测结果。本研究分别以DNA和对应的蛋白为检测目标,建立了基于DNA的Taqman探针荧光定量PCR法、电化学DNA传感器法和基于蛋白的LC-MRM/MS法。通过对致敏原DNA的检测,进行加工食品致敏原残留量的分析,可作为ELISA方法的有效补充。且DNA传感器相比PCR技术成本较低,操作简单,可微型化用于现场检测。基于蛋白的质谱方法相比同样检测蛋白的ELISA方法,可同步检测多种蛋白,且可直接检测过敏患者识别的的抗原决定簇。这三种方法的建立对食品牛奶致敏原的标示管理,保护消费者健康具有重要意义。