疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病，广泛流行于热带和亚热带一些发展中国家。疟疾的诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节，当前疟疾的发病率和死亡率难以控制的一个重要原因就是在疟疾流行区缺乏有效的诊断和治疗手段。传统依靠厚血膜镜检诊断方法已越来越不能适应当前疟疾诊断的需要。QBC法及Kawamoto法虽然敏感性比血涂片镜检法提高了8倍以上，特异性达98.4％，但其所使用的毛细管价格昂贵（每支0.8美元），又不能重复使用，操作上也较繁琐，且难以有效地进行虫株鉴别及虫体计数，因此难以在基层推广应用。八十年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术（分子杂交，PCR、套式PCR、荧光定量PCR等），显示了较高的敏感性和特异性，且能对疟原虫的感染作出早期快速的诊断，但也存在着需要特殊仪器设备和反应试剂较昂贵的问题。以免疫学为基础的血清学检测，特别是近几年来发展的以单抗为基础的Dipstick技术，由于操作简便、快速，结果易于判定，在疟疾诊断上日渐受到重视并展示了广阔的应用前景。目前美国、澳大利亚等已开发出ParaSight-F（Becton Dickinson，Cockeysoville，Maryland，USA）、ICT Malaria P.f和ICT Malaria P.f/P.v（ICT Diagnostics，Sydney，Australia）、OptiMAL（Flow Inc，Portland Oreg）等快速免疫诊断试剂盒，现场评估取得较好的效果。然而从国外进口这些试剂盒，价格昂贵。疟疾多发生于偏远贫穷的山区和乡村，病人难以负担较高费用，为适应此需要，亟待开发我国自己的快速免疫诊断试剂盒。 近年来发现疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）同宿主动物LDH在理化、免 第一军医大学博士学位论文疫学特性和酶学方面有很大的差异。在催化乳酸生成丙酮酸的反应中，LDHp能够迅速地利用 NAD类似物 3’－乙酚毗陡 NAD（APAD作为辅酶，而红细胞LDH①DHr）在APAD存在时参与这一反应速率很慢。另外，LDHP具有种、属特异性，因而是检测疟原虫理想的靶抗原。由于LDH仅由活虫体产生，血液中LDHp的水平与虫体血症呈平行相关，因此利用LDHp来检测还能鉴别虫体的死亡，由此可以鉴定疟原虫克隆株、监测药物的疗效及复燃情况。 本研究利用PCR技术钓取了恶性疟原虫海南株o）的乳酸脱氢酶编码基因，测定的序列与恶性疟原虫Honduras－l株LDH、诺氏疟原虫LDH以及其它生物LDH序列进行同源性分析，以探讨恶性疟原虫乳酸脱氢酶队DHPO独特的理化、免疫学及酶学特性的分子机制。将LDHPf编码基因克隆至 PGEX一T4表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，分析重组蛋白的免疫原性，纯化重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，结合免疫胶体金技术和 LDHpf的酶学特性分别建立了免疫胶体金层析测试pICA）法和免疫捕获 LDH活性检测（ICpLDH）法，并以镜检法、PCR法为对照，评价其检测恶性疟原虫的敏感性和特异性，同时与国外疟疾诊断试剂盒ICTZ进行平行检测对照。另外，根据LDHp能迅速地利用APAD作为辅酶参与原虫无氧酵解获得大部分三磷酸腺昔（ATP卜而LDHr参与此反应很慢这一特性，我们利用同工酶电泳技术对两者进行鉴别，利用酶比色法对LDHpf活性与原虫密度、培养时间的关系进行了初步研究。 结果显示，利用PCR技术成功地钓取了编码我国恶性疟原虫海南株o）乳酸脱氢酶的基因序列。并且将LD即f基因克隆到PGEX叶T－1表达质粒，经PCR、限制性酶切分析等鉴定，构建了PGEXIDH重组表达质粒，首次测定了编码我国恶性疟原虫海南株oCC IMN）乳酸脱氢酶编码基因的全序列，大小为95fop，无内含子。恶性疟原虫海南株LDH基因与Honduras－l株LDH基因比较显示，仅存在5个点突变，同源性高达99．47％，推导的氨基酸序列与已知诺氏疟原虫LDH氨基端的刀个氨基酸非常类似＊），说明该基因在恶性疟原虫株及疟原虫种之间高度保守。恶性疟原虫海南株LDH氨基酸序列与其它生物的LDH氨基酸相比，同源性较低，即使与BLAST检索 4 吴英松：恶性疟原虫乳酸脱氢酶基冈的克险、表达、单抗制各及疟炊诊晰研究 出的具有最高同源性的刚地弓形虫相比，也仅有49刀6％的氨基酸残基 相同，因此，LDHpf明显不同于其它生物LDH同工酶。恶性疟原虫海 南株LDH基因序列最大的特点有多处氨基酸的插入和缺夫，最明显在 90习4位有一独特的5个氨基酸（DKEWN）插入，这一插入可能决定了 LDHpf独特的理化。酶学特性。 重组质粒在大肠杆菌中表达出LDHpf与谷恍甘肽S－转移酶（GS）的 融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，破菌后的上清中也有少量 具有LDHpf酶学活性的重组蛋白。重组蛋白分子量约为60KDa，与理 论值基本符合，表达量约占菌体总蛋白的 门．96％，利用制备电泳法纯 化重组