犬布鲁氏菌为粗糙型球杆菌，是布鲁氏菌属中重要的生物型，不仅能感染各种犬，而且能感染人和其它动物，由该菌引起的布鲁氏菌病是一种人兽共患的自然疫源性疾病。犬布鲁氏菌病多为接触性感染，可以通过破损的皮肤粘膜和呼吸道传染，但主要的传播途径是消化道传染。感染犬种布鲁氏菌后有的无明显临床症状，呈隐性带菌状态；有的以生殖系统侵害为特征，如流产、睾丸炎、附睾炎，同时也伴有淋巴结炎、关节炎等症状。细菌菌壳是一种缺少细胞浆和核酸而导致无繁殖能力的细菌空壳形态。自然形成的菌壳是由感染了噬菌体PhiX174的大肠杆菌在溶菌周期由于宿主细胞裂解而形成的；人为制备菌壳技术主要利用基因工程技术依赖大肠杆菌噬菌体PhiX174的裂解基因E的表达产物在其寡聚化、构象改变及其它生化反应使大多数革兰氏阴性细菌形成一个40-200nm直径的跨膜孔道，导致宿主菌的细胞浆和核酸等细胞内容物在渗透作用下外流而溶菌形成菌壳。由于菌壳技术制备菌壳的过程中没有蛋白变性，细菌菌壳保留了与活菌完全一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，从而没有任何免疫原性的改变，是一种新型非变性灭活菌苗，比传统甲醛灭活菌苗在理论上具有更好的免疫原性和免疫保护效果。本研究首先构建了具有温控裂解功能的广宿主表达质粒pBBR1MCS-2-TLC，将其电转入犬布鲁氏菌中，筛选并得到了质粒型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株，该菌株在传至第18代时出现质粒丢失导致其无法生长。而为了克服质粒在布鲁氏菌中的遗传不稳定问题，本研究结合同源重组技术，构建了温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-B0419-TLC1，将温控裂解部件定向插入至犬布鲁氏菌基因组中，利用Kan和SacB基因的正、负向筛选标记，成功构建了基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株，该疫苗株为无抗性菌株，避免了抗性基因的存在，并且传至第30代仍具有良好的遗传稳定性。接着，对两种犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的溶菌动力学进行试验分析，经诱导条件优化，质粒型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株培养至OD600值约为1.2时，诱导30h后可制备得到裂解率达100%的犬布鲁氏菌菌壳，菌壳数约为5.30×1010个/mL；基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株培养至OD600值约为0.6时，诱导60h后可制备得到裂解率达100%的犬布鲁氏菌菌壳，菌壳数约为4.70×109个/mL。电镜观察犬布鲁氏菌菌壳可见细胞内容物经裂解孔道流失，并保留了完整的表面结构。综合考虑，基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株更适合作为犬布鲁氏菌病疫苗候选株。此外，探究了裂解蛋白E对布鲁氏菌的裂解效率可能与E基因的表达量、布鲁氏菌的生长状态以及其表型有着密切关联。最后，为了探究犬布鲁氏菌菌壳作为新型疫苗的应用价值，本试验分别对质粒型和基因组型犬布鲁氏菌菌壳的安全性和免疫原性进行评价。观察免疫小鼠生理状态和脾脏指数、克脾指数可得，两种犬布鲁氏菌菌壳不含任何活菌，且对小鼠无毒副作用，表明这两种犬布鲁氏菌菌壳具有良好的安全性。另外，犬布鲁氏菌菌壳免疫小鼠后，通过对小鼠血清抗体消长规律监测结果可知，犬布鲁氏菌菌壳能有效地产生特异性体液免疫，在第十周后还保持稳定的抗体效价，其中质粒型菌壳组（PBCG）和基因组型菌壳组（GBCG）的抗体水平能维持至少8周，而甲醛灭活组（FKB）和S2疫苗组（S2）的抗体水平分别只能维持3周和6周；小鼠脾淋巴细胞亚群检测分析则表明犬布鲁氏菌菌壳能诱导机体产生Th1型的细胞免疫应答；细胞因子体外实验结果显示菌壳组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌水平均显著高于空白对照组，IFN-γ、IL-2显著高于甲醛灭活组，IL-10显著高于S2疫苗组和甲醛灭活组，且两种犬布鲁氏菌菌壳组之间无显著差异，这说明犬布鲁氏菌菌壳可有效激起与S2疫苗株相当的细胞免疫反应。用犬布鲁氏菌RM6/66株攻毒免疫小鼠，结果表明基因组型犬布鲁氏菌菌壳在小鼠体内能提供良好的免疫保护力，免疫保护单位为2.37；用羊布鲁氏菌16M株攻毒免疫小鼠，基因组型犬布鲁氏菌菌壳则能提供部分的免疫保护力，免疫保护单位为1.60。综上所述，本研究成功构建了质粒型和基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株，经诱导条件优化制备了表面结构完整的犬布鲁氏菌菌壳，该菌壳作为新型犬布鲁氏菌病灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性，应用前景十分广阔。