【摘 要】
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细胞色素P450酶（P450或CYPs）是一类含血红素的单加氧酶,与生物内源性物质和外来化学物质的氧化代谢相关。CYP3A5与CYP2D6作为P450重要亚型酶参与多种药物和致癌物的氧化代谢,由于受遗传多态性及环境等因素的影响,酶的表达在不同个体间存在明显差异。这一个体差异极大的限制了对酶在药物代谢中的了解,且很多疾病和癌症的发生与酶活性的改变有关。因此,需要开发出一种有效便捷的方法检测CYP3A
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFF0215204）; 江苏省重大成果转化基金（BA20170315、BA2019052）
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细胞色素P450酶（P450或CYPs）是一类含血红素的单加氧酶,与生物内源性物质和外来化学物质的氧化代谢相关。CYP3A5与CYP2D6作为P450重要亚型酶参与多种药物和致癌物的氧化代谢,由于受遗传多态性及环境等因素的影响,酶的表达在不同个体间存在明显差异。这一个体差异极大的限制了对酶在药物代谢中的了解,且很多疾病和癌症的发生与酶活性的改变有关。因此,需要开发出一种有效便捷的方法检测CYP3A5和CYP2D6酶活性,探索其在药物代谢及相关疾病病理过程中的作用,为个体化治疗和相关药物研发提供技术支持。以荧光探针为分子工具的荧光分析法凭借其选择性好、灵敏度高、操作简单等独特优势引起了研究者的关注。花菁类染料具有较强的分子内电荷转移（ICT）效应、结构易修饰、优异的光物理性能和良好的水溶性,因此被选作水溶性荧光探针的荧光团。近红外（NIR）的荧光探针因具有良好的生物相容性和较深的组织穿透性,可作为理想的活体成像分子工具受到越来越多的关注。本论文利用分子设计策略,以花菁染料为母体荧光团合成了2个不同系列的反应型荧光探针,分别用于CYP3A5和CYP2D6酶活性的特异性检测。主要研究内容如下:1)基于半花菁衍生物为荧光母核,开发了两种用于细胞色素P450酶检测的近红外比率型荧光探针（E）-2-（2-（6-（（4-（2-溴乙氧基）苄基）氧基）-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基）乙烯基）-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘化物（Hcy-Br）和（E）-2-（2-（6-（（4-（2-氯乙氧基）苄基）氧基）-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基）乙烯基）-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘化物（Hcy-Cl）。其中,Hcy-Br对CYP3A5介导的催化脱溴乙基化表现出良好的的特异性、高灵敏度（LOD=0.049 n M）和近红外比率荧光响应。在模拟的酶催化反应体系中,Hcy-Br在670 nm处具有荧光发射,当向体系中加入CYP3A5时,670 nm处荧光强度逐渐下降并在713 nm处产生新的荧光发射峰,且在30 min内荧光强度达到最大。催化机理的研究表明,Hcy-Br首先被CYP3A5催化去除溴乙基,随之分子内发生1,6-消除反应得到荧光团而发射出强烈的近红外荧光。由于探针Hcy-Br的NIR发射和低细胞毒性,已将其成功应用于活细胞和荷瘤小鼠中荧光成像以实时监测内源性CYP3A5活性。此外,由于Hcy-Br具有独特的季胺N+,因此在活细胞中具有优良的的线粒体靶向功能。综上,Hcy-Br是一种潜在的可用于检测CYP3A5酶相关疾病的优良分子工具。2)以花菁衍生物为母体荧光团,利用不同的烷氧基取代羟基氢原子制备了3种“off-on”型荧光探针:（E）-1-乙基-2-（4-甲氧基苯乙烯）-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘化物（Cy-Me）、（E）-1-乙基-2-（4-（（4-甲氧基苄基）氧基）苯乙烯基）-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘化物（Bn Cy-Me）和（E）-2-（4-（（4-（2-氯乙氧基）苄基）氧基）苯乙烯基）-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘化物（Bn Cy-Cl）,以期筛选出对目标酶具有特异性响应的荧光探针。研究结果显示,探针Cy-Me对CYP2D6介导的催化脱甲基化表现出良好的的特异性,探针自身几乎不发荧光,被CYP2D6催化脱去甲基后释放出荧光团（Cy-OH）,从而使样品在553 nm处荧光强度出现显著增强,约为反应前的9倍,同时溶液体系颜色由黄色变为微粉色,可肉眼辨别。酶浓度响应实验表明,Cy-Me对CYP2D6酶浓度的线性响应范围为0-18 n M,理论检测限低至0.052 n M。同时探针Cy-Me可用于检测人肝微粒体（HLM）中CYP2D6的活性,且能够用于筛选CYP2D6抑制剂。探针Cy-Me具有低细胞毒性（50μM,细胞存活率＞80%）,已成功用于活细胞和小鼠中以实时监测其内源性CYP2D6酶活性。
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