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植物的耐逆性是信号网络中多个基因相互作用、共同调控的结果,为了更好地理解植物耐逆性相关机制,有必要研究植物基因在非生物胁迫情况下的表达模式。利用基因芯片,本实验室建立了盐和非盐胁迫下的大豆基因表达图谱,比较了它们的表达差异,筛选出与耐盐胁迫有关的多个候选基因。本文从候选基因中克隆了一个锌指蛋白转录因子基因和一个蛋白激酶基因,对它们在耐逆性中的作用进行了研究。主要研究内容和结果包括：通过比较大豆盐及非盐胁迫下的基因表达差异,发现17个锌指蛋白家族基因和26个蛋白激酶家族基因在盐胁迫下上调表达。在上述上调表达的2类基因中筛选并克隆了1个锌指蛋白基因GmZnFl和1个蛋白激酶基因GmPK6,并进行了功能研究。1GmZnF1的克隆与初步功能分析1.1GmZnF1基因的芯片结果验证半定量RT-PCR分析表明,GmZnFl基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长,表达量逐渐增加。1.2GmZnFl蛋白结构、性质及系统进化分析GmZnF1基因编码的蛋白是典型的C2H2-ZnF蛋白,具有一个跨膜结构域,一个复杂性较低的区域和一个DPBB-1样结构域。GmZnF1蛋白的疏水性较强,推测可能含有跨膜结构域。GmZnFl和油菜RING型E3泛素连接酶的同源性较高(99.0%),与拟南芥中玉山筷子芥锌指家族蛋白有同源性(48.0%),并且与蒺藜苜蓿E3泛素蛋白连接酶有同源性(38.0%)。1.3GmZnF1转录激活活性分析利用酵母转录激活体系证明该蛋白具有转录激活活性,从而佐证了该基因是转录因子。1.4GmZnFI基因表达模式分析qPCR结果表明GmZnFI在大豆的根、茎和花中表达量最高,在叶片和种子中表达量较低,且其表达受ABA、盐胁迫、干旱和冷胁迫的明显诱导,在盐和旱诱导条件下的上调表达尤其明显。1.5GmZnF1的克隆及拟南芥过表达株系的获得从“圣豆9号”中首次分离了1个锌指蛋白基因CDS序列,命名为GmZnF1,序列长度分别为834bp,分别编码278个氨基酸。克隆GmZnF1基因CDS全长,构建植物过表达载体,并转化筛选拟南芥,得到该基因的过表达纯系植株。1.6拟南芥GmZnF1过表达系的抗逆性分析通过比较不同盐浓度下的种子萌发率,发现随着盐浓度的梯度升高,拟南芥35S::GmZnF1系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显。对不同盐浓度下主根平均长度的比较发现,含有150mM和200mM氯化钠的1/2MS培养基上,35S::GmZnF1系植株的数据比野生型的数值大。盐浓度梯度处理结果显示,过表达系植株的耐盐旱能力显著高于野生型对照组的植株。综上所述,GmZnF1在拟南芥中的异位表达提高了拟南芥的耐盐性。1.7拟南芥35S::GmZnFl生理实验指标测定在2.0μM ABA,200mM NaCl,250mM甘露醇以及4.0℃冷胁迫条件下,转基因株系的SOD, POD, CAT,丙二醛和脯氨酸,与对照组相比均有不同程度的升高,揭示转基因系对这些逆境有一定的抗性,细胞结构更加稳定,膜系统不易降解。1.8大豆转化与检测使用含有目的基因的表达载体的农杆菌,使用组培方法转化大豆,然后对T1代植株进行检测：其中的35S::GmZnF1阳性植株,利用CTAB法提取DNA,进行Southern Blot检测。结果表明,在收获的T1代植株300棵植株中,共有阳性植株6棵,阳性比例2.0%,检测为阳性植株中的该目的基因都是单拷贝插入基因组。2GmPK6的获得与初步功能分析2.1GmPK6基因的芯片结果验证RT-PCR分析表明,GmPK6基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长而逐渐增加。2.2GmPK6蛋白结构、性质及系统进化分析GmPK6基因编码的蛋白蛋白激酶,属于LAMMER类型的亚家族。结果显不：GmPK6与Glycine max PKC-like, Arabidopsis thaliana AFC2, Arabidopsis thaliana FUS3和烟草PK12的同源性较高(～100.0%),其次是与蓖麻AFC有同源性(43.0%)。2.3GmPK6蛋白表达克隆含有酶切位点的基因GmPK6,使用pGEX GST4T-1载体构建重组载体,并且转化Rosseta菌株。PCR检测阳性菌株,二次活化后,取出适量菌液作为0hr对照组,其余菌液中加入IPTG(终浓度1.0mM),28.0℃摇菌诱导目的蛋白表达,并且在3hr,6hr和8hr时间点分别取样。SDS-PAGE电泳表明,目的蛋白在3h开始表达,表达量随时间逐渐增多。2.4GmPK6表达模式分析qPCR结果表明,GmPK6在大豆的根、茎和叶片中表达量最高,在花和种子中表达量很低；而且GmPK6明显受ABA、盐、干旱和冷胁迫的诱导。2.5GmPK6的克隆及拟南芥过表达株系的获得从“圣豆9号”中首次分离了1个蛋白激酶基因CDS序列,命名为GmPK6,序列长度分别为1419bp,分别编码473个氨基酸。克隆了GmPK6基因CDS全长,构建了植物表达载体,并转化拟南芥野生型植株,得到此基因的过表达纯系。2.6拟南芥GmPK6过表达系的抗逆性分析比较不同盐浓度梯度下种子萌发率,发现随着盐浓度的升高,过表达系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显,并且差异显著。比较在不同盐浓度下的主根平均长度发现,在含有150mM以及200mM氯化钠的1/2MS培养基上,过表达系植株的主根长度比野生型植株的有显著增长。叶片失水率结果显示,35S::GmPK6过表达系植株叶片的失水率低于野生型,揭示转基因株系的植株有较强的保水能力。拟南芥35S::GmPK6系耐冷性分析结果显示,植株在10h冷胁迫处理(4.0℃)后表现出明显的耐冷性,存活率与对照组相比有显著提高。2.7拟南芥35S::GmPK6生理实验指标测定在2.0μM ABA,200mM NaCl,250mM甘露醇以及4.0℃冷胁迫条件下,35S::GmPK6转基因株系的SOD,POD,CAT,丙二醛和脯氨酸,与对照组相比均有不同程度的升高,揭示转基因株系对这些逆境有一定的抗性,细胞结构更加稳定,膜系统抗氧化能力增强。2.8大豆转化与检测使用含有目的基因的表达载体的农杆菌,使用组培方法转化大豆,然后对T1代植株进行检测：其中的35S::GmPK6阳性植株,利用CTAB法提取DNA,进行Southem Blot检测。结果表明,在收获的T1代植株800棵植株中,共有阳性植株20棵,阳性比例2.5%,检测为阳性植株中的该目的基因都是单拷贝插入基因组。