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目的:针对单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type2, HSV-2)的UL29基因,构建了4组短发夹RNA(Small hairpin RNA, shRNA)表达质粒—pGPU6/GFP/Neo/shRNA UL29,并对 UL29shRNA表达质粒进行了筛选。通过将筛选的 UL29shRNA表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦(Aciclovir, ACV)的抗病毒效果及细胞毒性进行比较,探讨RNA干扰在细胞水平上对HSV-2病毒的抑制效果。 方法:根据shRNA的一般设计原则,针对HSV-2的UL29基因设计出四组表达质粒,通过病变抑制率、mRNA相对表达量从中筛选出一组干扰效果最好的表达质粒—UL29-shRNA1641。以pGPU6/GFP/Neo/UL29-shRNA1641作为RNA干扰组与抗病毒药ACV进行对HSV-2的抑制效果的比较研究。预实验中通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定ACV的最大无毒浓度(maximal atoxic concentration, TC0)和ACV的半数有效浓度(Half effective concentration, EC50),分别用于病毒抑制效果的实验和细胞毒性的实验。UL29-shRNA1641与ACV抑制HSV-2的实验分为3个实验组:RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组。采用CCK-8法检测病变抑制率,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-PCR)检测UL29mRNA的相对表达量, Karber法检测细胞上清液中病毒滴度的变化、蛋白印迹法(Western blot)检测ICP8的相对表达量,对 RNAi与 ACV抑制效果进行比较;通过 WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法和台盼蓝染色计数法对质粒转染复合物(质粒+转染试剂)和ACV的细胞毒性进行比较。 结果:(1)通过病变抑制率、mRNA相对表达量检测表明,4组UL29shRNA表达质粒对HSV-2均有一定的抑制效果,以其中UL29-shRNA1461对基因表达抑制率最高,为最佳干扰组。(2)预实验中 Karber法测定扩增后的病毒滴度为 TCID50=10-5.375/100μl,CCK-8法测定ACV的TC0和EC50分别为5.0μg/ml和31.7μg/ml。(3)CCK-8法检测病变抑制率的结果显示,RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组细胞病变抑制率分别为35.35±0.98％、43.95±1.31%和85.82±1.13%,其中RNAi组比ACV组病变抑制率低(P﹤0.05),RNAi+ACV组的病变抑制率明显高于RNAi组和ACV组(P﹤0.05)。(4)RT-PCR检测三组mRNA的相对表达水平,RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组均能不同程度降低mRNA相对表达量。RNAi组UL29基因相对表达量高于ACV组(P﹤0.05);RNAi+ACV组UL29基因相对表达量明显低于RNAi组和ACV组(P﹤0.05)。(5)Karber法检测三组细胞上清液病毒滴度表明,阴性对照组的上清病毒滴度为10-5.4±0.3/100μl,RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组上清液病毒滴度分别为10-4.0±0.2/100μl、10-3.7±0.2/100μl和10-2.9±0.3/100μl,三组与阴性对照相比均有显著性差异(P﹤0.05),RNAi组病毒滴度高于ACV组(P﹤0.05),RNAi+ACV组的病变病毒滴度明显低于RNAi组和ACV组(P﹤0.05)。(6)Western blot检测ICP8相对表达量, RNAi组、ACV组和 RNAi+ACV组均能不同程度降低 ICP8表达,ACV组的 ICP8相对表达量比RNAi组低(P﹤0.05)。RNAi+ACV组ICP8相对表达量降低最为明显,与ACV组和RNAi组相比有显著差异(P﹤0.05)。(7)WST-1法对转染复合物与ACV的细胞毒性进行比较, RNAi组和 ACV组细胞死亡率分别为23.65±1.33%和39.48±1.25%;台盼蓝染色计数法对转染复合物和 ACV的细胞毒性进行比较,RNAi组和ACV组细胞死亡率分别为18.55±1.98%和42.22±3.23%。RNAi组与ACV组相比均有显著性差异(P﹤0.05)。说明RNAi中质粒和转染试剂对细胞的毒性明显小于ACV。 结论:设计的4组UL29shRNA表达质粒均能抑制UL29基因和ICP8的表达。其中UL29-shRN1461干扰果最好。以UL29-shRN1461作为干扰组和ACV进行抑制HSV-2和细胞毒性的比较。在病变抑制率、子代病毒滴度、UL29基因mRNA相对表达量和ICP8的相对表达量检测中,RNA干扰组对HSV-2的抑制效果不如ACV组(P﹤0.05), RNAi+ACV组抑制效果最好,与ACV组有显著性差异(P﹤0.05)。转染复合物(质粒+转染试剂)与ACV的细胞毒性比较中,加入转染复合物对细胞的影响较小,细胞死亡率较低(P﹤0.05)。