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第一部分:EEF2K在食管鳞癌中的临床病理学研究目的:观察EEF2K在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达,探究其与食管鳞癌患者的临床病理的关系。方法:包含100对手术切除的食管鳞癌(Ⅰ-Ⅳ期)与癌旁组织使用组织芯片点样仪将标记好的组织按照设计排列在空白石蜡快上,使用切片机对阵列蜡块进行连续切片,得到组织芯片。通过EEF2K抗体免疫组化后进行染色强度的判定:在低倍显微镜下进行观察,分为弱阳性(浅黄色,+或1)、中阳性(棕黄色,++或2)及强阳性(棕褐色,+++或3)。结果:共100例食管鳞癌患者纳入本研究。男性74名,女性26名。平均年龄65.3岁,年龄分布为48-82岁。颈段食管癌38例,胸上段5例,胸中段25例,胸下端25例。Ⅰ-Ⅱ期75例,Ⅲ期25例。T分期:T1 4例,T2 11例,T3 79例,T4 3例。N分期:N1 45例,N2 32例,N3 17例,N4 5例。临床分期:1期4例,2期42例,3期50例。EEF2K蛋白在食管鳞癌组织中的表达显著高于癌旁组织中。EEF2K在食管鳞癌中的免疫组化评分为4.66±2.69,在癌旁组织中的评分为2.55±1.46。结论:EEF2K在食管鳞癌组织中存在高表达,为食管鳞癌的发生发展和治疗抵抗机制的进一步探究提供了依据。第二部分:EEF2K在食管鳞癌中的肿瘤生物学研究目的:构建EEF2K高表达与低表达的食管鳞癌细胞株,探究EEF2K表达对食管鳞癌细胞增值、迁移、侵袭、成瘤能力的影响。方法:通过慢病毒载体构建EEF2K过表达与敲低的稳转细胞株,通过RT-PCR,免疫印迹,免疫荧光验证细胞中EEF2K的表达。通过CCK8检测不同EEF2K表达的细胞增值能力的差异,通过不含Martigel的transwell实验检测不同EEF2K表达的细胞迁移能力的差异,通过含Martigel的transwell实验检测不同EEF2K表达的细胞侵袭能力的差异,通过裸鼠移植瘤实验检测不同EEF2K表达的细胞成瘤能力的差异。结果:我们成功构建 EEF2K 过表达 ECA109 细胞(ECA109 EEF2K Overexpression)、过表达对照 ECA109 细胞(ECA109 Empty Vector)、EEF2K 敲低 ECA109 细胞(ECA109 EEF2K shRNA)、敲低对照 ECA109 细胞(ECA109 Scramble shRNA)、EEF2K 过表达 TE13 细胞 TE13 EEF2K Overexpression)、过表达对照 TE13 细胞(TE13 Empty Vector)、EEF2K 敲低 TE13 细胞(TE13 EEF2K shRNA)、敲低对照 TE13 细胞(TE13 Scramble shRNA)。CCK8实验表明,EEF2K表达与食管鳞癌细胞增值能力有关。不含Matrigel的Transwell实验表明,EEF2K表达与食管鳞癌细胞迁移能力相关。含Matrigel的Transwell实验表明,EEF2K表达与食管鳞癌细胞侵袭能力相关。与过表达对照组相比,EEF2K过表达ECA109细胞注射的裸鼠移植瘤的肿瘤体积在接种10天以后增长速度提高。与敲低对照组相比,EEF2K敲低ECA109细胞注射的裸鼠移植瘤的肿瘤增长在接种5天以后增长速度减慢。免疫组化染色分别检测了过表达对照组、EEF2K过表达组、敲低对照组、EEF2K敲低组肿瘤组织中的EEF2K、p-AKT、Ki-67表达情况以及HE染色差异,其表达与EEF2K相关。结论:EEF2K在食管鳞癌细胞增值、迁移、侵袭等生物学行为发挥作用,EEF2K在食管鳞癌中发挥癌基因的功能。第三部分:EEF2K在食管鳞癌中的放射生物学研究目的:探究EEF2K与食管鳞癌细胞放射抵抗的关系,升高或者降低EEF2K的表达对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响。方法:通过免疫印迹检测X射线辐照后EEF2K的表达变化。克隆形成实验评价EEF2K对食管鳞癌放射敏感性的影响,利用克隆形成率反应细胞群体依赖性和增殖能力。通过激光共聚焦显微镜观察6 Gy辐照后各组细胞24 h Foci形成以及变化趋势,来评估不同EEF2K表达状态对辐射引起DNA双链断裂的影响。通过免疫印迹检测凋亡蛋白Bcl-xL、Bcl-2、Bax和自噬蛋白LC3B、Beclin-1、Atg5在不同EEF2K表达的食管鳞癌细胞系的表达差异。结果:Western blot检测表明在ECA109和TE13细胞中,X射线能诱导EEF2K与p-EEF2的表达,且随着剂量提高,上述两种蛋白的表达增加。放射生物学实验表明,在食管鳞癌细胞中过表达EEF2K能够提高D0、Dq,降低SF2;敲低EEF2K能够降低D0、Dq,提高SF2。实验表明EEF2K过表达ECA109细胞的辐照后Foci低于过表达对照ECA109细胞,EEF2K敲低ECA109细胞的辐照后Foci低于敲低对照ECA109细胞。经过8 Gy辐照后,Bcl-xL、Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增高;EEF2K过表达组Bcl-xL、Bcl-2蛋白表达降低及Bax蛋白表达增高程度显著高于过表达对照组;EEF2K敲低组Bcl-xL、Bcl-2蛋白表达降低及Bax蛋白表达增高程度显著低于过表达对照组。在经过8 Gy辐照后,LC3B、Beclin-1和Atg5均增高,其中EEF2K过表达组LC3B、Beclin-1和Atg5增高比过表达对照组更明显,然而EEF2K敲低组LC3B、Beclin-1和Atg5增高没有敲低对照组明显。结论:EEF2K在食管鳞癌中促进细胞的放射抵抗,其对放射敏感性的影响可能是通过对细胞自噬与凋亡平衡调控发挥作用。第四部分:EEF2K抑制剂对食管鳞癌放疗增敏的临床前研究目的:探究EEF2K抑制剂NH125对食管鳞癌细胞的放射增敏作用,评估其作为食管鳞癌放疗增敏剂的可行性。方法:通过CCK8检测NH125单药对食管鳞癌细胞的抑制作用,通过克隆形成实验检测NH125对食管鳞癌细胞的放射增敏作用。通过免疫印记检测NH125联合X线辐照后EEF2K蛋白的表达变化。通过裸鼠移植瘤实验检测NH125在体内的放射增敏作用。结果:NH125单药对食管鳞癌细胞株的抑制增殖作用。NH125作用24 h,ECA109与TE13细胞的半数致死剂量IC50分别为为6.25 μ mol/L、6.40 μ mol/L,NH125作用48 h,ECA109与TE13细胞的半数致死剂量IC50分别为为5.08 μ mol/L、4.85 μ mol/L。0.1 μmol/L NH125 作用于 ECA109 细胞,获得 DO 为 1.89,Dq为 1.43,SF2 为 1.06;0.25 μmol/L NH125 作用于 ECA109 细胞,获得 DO 为1.62,Dq 为 1.05,SF2 为 1.24。0.1 μmol/LNH125 作用于 TE13 细胞,获得 D0为 1.75,Dq 为 1.47,SF2 为 1.14;0.25 μmol/L NH125 作用于 ECA109 细胞,获得 D0 为 1.54,Dq 为 1.00,SF2 为 1.30。Western-blot 分析再 8Gy 辐照和0.25μmol/L NH125 处理 ECA109 和 TE13 细胞后,其中 EEF2K 与 p-EEF2 蛋白表达相对量。裸鼠移植瘤模型显示:对照组、单纯用药组、单纯放疗组、放疗加用药组肿瘤体积分别为:1961±277.02mm3、1259.2±273.71mm3、1608.8 ±363.54mm3、736.4±260.26mm3。对照组的肿瘤倍增时间为4.3±0.7天,单纯用药组为6.0±0.9天,单纯放疗组为7.1±0.8天,放疗加用药组为10.9±1.7天。放疗加用药组的肿瘤增长延迟为4.9天。NH125的增敏比为1.8。结论:NH125是食管鳞癌细胞有效的放射增敏剂,在食管鳞癌放疗中靶向EEF2K增敏具有潜在的临床价值。