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促性腺激素释放激素受体(GnRHR)是一种位于垂体促性腺细胞表面的G蛋白耦联受体,转导促性腺激素释放激素(GnRH)信号调节促黄体激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的合成和分泌,在调控生殖器官发育和繁殖过程中起到重要作用。禽类具有两种GnRHR,分别为GnRHR-I与GnRHR-Ⅱ,其中GnRHR-1基因在下丘脑、垂体、性腺以及心脏等组织中广泛表达,GnRHR-Ⅱ基因在下丘脑、垂体及性腺均有表达,且垂体中表达量最高。有研究显示,哺乳动物中GnRHR基因的表达受到组蛋白修饰和DNA甲基化的影响;而对于GnRHR-Ⅱ基因在鸡性成熟发育过程中下丘脑与卵巢组织中的甲基化变化特征尚不清楚。本实验采用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测性成熟发育不同阶段鸡下丘脑及卵巢组织中GnRHR-Ⅱ基因甲基化变化特征,在表观调控层面探讨其在性成熟中的调控作用。(一)本研究检测了30、90、110及150日龄济宁百日鸡下丘脑和卵巢中GnRHR-Ⅱ基因启动子和外显子区甲基化变化规律,结果显示:(1)30~150日龄时GnRHR-Ⅱ基因在下丘脑组织中总甲基化水平平均为60%;在卵巢组织中总体甲基化水平平均为40%。(2)30~150日龄时下丘脑和卵巢组织中GnRHR-Ⅱ基因外显子区甲基化水平均始终显著高于启动子区(P<0.05)。4个不同发育时期下丘脑组织中GnRHR-Ⅱ基因启动子区总甲基化水平高于卵巢组织。(3)下丘脑和卵巢组织中,GnRHR-Ⅱ基因启动子区在90日龄时总甲基化水平最低,其中下丘脑组织为27.8%,卵巢组织为15%;下丘脑和卵巢组织中GnRHR-Ⅱ基因外显子区均在110日龄时总甲基化水平最高,其中下丘脑中为83.4%,卵巢中为89.9%。(4)下丘脑组织与卵巢组织中GnRHR-Ⅱ基因启动子区甲基化水平显著变化位点并不完全重合,对这些位点进行转录因子结合位点预测,结果发现下丘脑的-497和-254位点与卵巢的-500位点都存在具有CG趋向性结合的转录因子ZF5;下丘脑的-241位点与卵巢的-235和-84位点都存在KLF转录因子。在下丘脑和卵巢均表现显著变化的-188位点结合bHLH转录因子家族。(二)对GnRHR-Ⅱ基因进行5′调控区长度为3282片段进行双荧光素酶活性检测,发现:GnRHR-Ⅱ基因启动子区-3363~-81区域内各片段均呈现很低的荧光活性,-446~-81区段活性最低,该区域为一个含有28个CG位点的CpG岛。(三)对GnRHR-Ⅱ基因启动子区SNP位点进行筛选,结果发现在-1334~+236区段存在9个SNPs,其中有3个为CpG-SNP。-828位点C>G突变与鸡的产蛋数性状显著关联(P<0.05),在隐性白洛克鸡和济宁百日鸡两个群体中均发现,GG基因型对应较低的产蛋数。转录因子预测结果表明由C变成G时减少了一个转录因子E2F的结合位点。综上,本研究通过对济宁百日鸡性成熟发育不同阶段的下丘脑和卵巢组织中GnRHR-Ⅱ基因甲基化水平分析,揭示了该基因在鸡性成熟发育过程中其启动子区和外显子区甲基化变化差异,以及卵巢和下丘脑组织中的甲基化水平变化差异;对鸡GnRHR-Ⅱ基因启动子区进行活性检测和SNP分析,揭示该基因启动子区-3363~-81 bp的片段内启动活性极低,其5′调控区-828位点的CpG-SNP可作为蛋鸡育种中产蛋数的分子标记。