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研究背景与目的：当前的抗抑郁药低有效率低已成为抑郁症治疗最突出的临床难题之一。近年来基因工程鼠研究表明TREK1亚型双孔钾离子通道(TWIK-related mechano-gated two pore K+ channel)是抗抑郁治疗的靶点,阻断该通道与提高抗抑郁剂疗效相关。而药物基因组学研究也表明TREK1基因多态性与抗抑郁剂耐药有关。然而目前尚缺乏理想的TREK1通道阻断剂,阻断TREK1通道发挥抗抑郁效应的机制也知之甚少。因此本课题拟筛选高效TREK1阻滞剂,评估其抗抑郁疗效,并进一步探讨阻断TREK1通道发挥抗抑郁样作用的机制。方法： 1.通过分子克隆技术构建TREK1钾通道重组质粒TREK1-pCDNA3.1(+)/ pEGFP-Nl,并将质粒转染人胚肾293细胞(Human embryonic kidney, HEK293),实现TREK1通道蛋白体外表达。2.利用铊离子荧光高通量筛选法筛查中国科学院上海药物所国家化合物库,筛选可能阻断TREK1通道的化合物；利用全细胞膜片钳技术检验筛选化合物对TREK1钾通道的敏感性、特异性。3.利用表面等离子体共振(Surface plasmon resonance, SPR)技术测定筛选化合物与TREK1和五羟色胺1A受体(5-hydroxytryptamine receptor 1A,5-HTRia)亲和力。4.通过药代动力学实验确定筛选化合物干预动物模型的有效剂量。5.通过慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)结合孤养法建立抑郁症动物模型,给予筛选的TREK1阻断剂、文献报道的TREK1阻断剂spadin和抗抑郁剂西酞普兰进行干预,利用强迫游泳实验(Forced swimming test, FST)、开场实验(Open field test, OFT)及蔗糖水偏好实验(Sucrose preference test, SPT)评估筛选化合物的抗抑郁疗效。6.通过场电位电生理实验测量阻断TREK1后抑郁模型大鼠中缝核(Dorsal raphie nuclei, DRN) 5-HT能神经元、前额叶(Prefrontal cortex, PFC)锥体神经元场电位的变化。7.利用免疫印迹及real-time PCR方法检测阻断TREK1通道后2周及4周抑郁模型大鼠DRN、 PFC及海马CA1/CA3区蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)、环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)表达变化。8.利用全细胞膜片钳技术检测5-HTR1A激动剂和拮抗剂对表达在HEK293细胞膜上TREK1通道钾电流的影响；在原代培养的孕17天胎鼠海马神经元中分别应用筛选的TREK1阻断剂和文献报道的TREK1阻断剂spadin,并同时给予5-HTR1A激动剂和拮抗剂干预24h,通过免疫印迹法观察5-HTR1A功能对神经元PKA、 CREB和BDNF信号分子表达的影响。结果：1.高通量筛选的化合物SID1900抑制TREK1通道荧光强度的IC50值为28.72+3.67μM,该化合物在0mV下阻断TREK1通道钾电流的ICso值为29.72+2.4μM,，且.对原代培养的海马神经元双孔钾离子通道(Two pore K+ channel, K2P)具有特异性阻断作用(p<0.001,1C50=87.09±4.2μM),对Na+、Ca2+和混合K+离子通道无显著影响(p>0.05)。2.SPR动力学数据显示：不同浓度SID1900与TREK1钾离子通道均具有较高亲和力,平衡解离常数(KD)为1.905×10-10M。3.药代动力学数据表明：SID1900可通透大鼠血脑屏障(通透率78.74%)且生物利用度良好(78.03±9.65%),有效干预剂量为14.33 μM/kg。4.与CUMS应激抑郁模型组相比,SID1900干预2周可显著减少大鼠FST不动时间p<0.001),疗效早于西酞普兰一周；另外在改善大鼠OFT水平活动、垂直活动评分及恢复蔗糖水偏好性方面,SID 1900也显著优于西酞普兰(p=0.001,p＜0.001, p=0.031),与spadin一致。5.场电位电生理实验结果表明：用SID 1900 (14.33 μM/kg, i.p.)干预4周后,应激抑郁大鼠DRN区5-HT能神经元和PFC区锥体神经元电冲动发放率(Firing rate)分别为：(4.35+0.61)Hz和(5.02±0.82)Hz,与模型组相比显著增加(p=0.014,p=0.003),明显高于西酞普兰(p<0.05),与spadin干预结果一致。另外SID 1900、spadin和西酞普兰分别于给药6min、 7min40s和9min40s后显著增加CUMS模型大鼠DRN区5-HT能神经元firing rate。 6. real-time PCR和免疫印迹检测结果表明：SID1900干预CUMS模型大鼠2周可显著上调中缝核、海马CA1/CA3和PFC区PKA、 CREB和BDNF mRNA及BDNF蛋白表达(与模型组相比p<0.001),这与spadin干预2周和西酞普兰干预4周的结果接近。7.在0mV下30μM5-HTR1A激动剂8-OH-DPAT可增强19.14±1.34% TREK1通道钾电流,而10μM5-HTR1A拮抗剂WAY 100635可阻断17.18±1.26% TREK1钾电流；在原代培养的海马神经元中同时应用8-OH-DPAT和SID1900较单独应用SID1900对上调PKA-CREB-BDNF表达效果更显著(p<0.05),而同时给予WAY100635和SID1900与单独应用SID1900相比,PKA-CREB-BDNF表达显著降低(p<0.05)。另外,SPR数据显示：不同浓度SID1900与5-HT1A受体均具有较低亲和力,平衡解离常数(KD)为2.597×10-4M。结论 1.本研究筛选的化合物SID1900可有效阻断TREK1通道,对双孔钾离子通道具有较高特异性； 2.SID1900可顺利通透血脑屏障且生物利用度良好,干预应激抑郁大鼠模型可产生显著抗抑郁样反应；3.5-HTR1A在阻断神经元TREK1通道后上调PKA-CREB-BDNF表达过程中可能发挥重要的协同作用；4.SID1900发挥抗抑郁样效应可能与阻断TREK1通道后增强5-HT传递、5-HTR1A协同效应及中缝核、PFC和海马CA1/CA3区PKA-CREB-BDNF信号表达有关。