前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen）由KLK3基因编码，KLK3基因位于19q13.2-q13.4，基因全长6KB，含有5个外显子和4个内含子，转录后的mRNA全长1446 bp，转录受雄激素调节。目前发现PSA在多种组织和体液中表达，精浆中的浓度最丰富，浓度可达0.5－2mg/ml，因为PSA具有丝氨酸蛋白酶和类胰凝乳酶活性，特异性降解精浆中的丝氨酸蛋白酶样和糜蛋白酶的特异性底物—semenogelins和fibronectin，液化精浆凝块，增加精子的活动力,而且PSA通过其激肽释放酶作用使精液中缓激肽或缓激肽样代谢物增加，缓激肽或缓激肽样物质能诱导平滑肌收缩，使精子活力增加，有利于受精。自1979年Chu及其同事揭示PSA与前列腺癌有相关性以来，学者们一直着重于PSA在前列腺癌的诊断、监控和预后评价的研究，虽然PSA与精浆的液化有关，但PSA的浓度和形式是否影响精浆的液化，从而在男性不育发病起一定因素，尚无进一步的研究。本教研室的前期工作发现，在少-弱精，液化不良，高黏度和高白细胞精液时PSA在精浆总蛋白中比例显著低于正常精液，其水平仅相当于正常精液的50%左右。我们认为PSA的浓度<WP=89>降低可能是精液状态异常的原因，为进一步探讨PSA在男性不育的诊断和体外改善精液质量的价值，本实验在毕赤酵母中表达具有活性的天然PSA。实验中，首先从前列腺组织中提取总mRNA,逆转录获得人全长cDNA序列，PCR方法获得编码人PSA全长的cDNA序列，连入pGEM－T载体，命名为pGEM－PSA质粒，测序。正确后，重新设计带有酶切位点（Xhol I, Xbal I）和酵母Kex2 signal cleavage识别序列(AAAAGA)的引物，获得成熟PSA的cDNA序列，连入pGEM－T载体，命名为pGEM－mPSA质粒。双酶切pGEM－mPSA质粒和pPICZα－C质粒，将mPSA片段和载体大片段连接，构建表达载体，将其命名为pPICZα－mPSA。测序鉴定PSA基因正确插入酵母表达载体。PmeI酶切表达载体pPICZα－mPSA，线性化，电转转染X33感受态细胞，进行甲醇诱导表达，ELASA试剂盒检测表达水平，筛选出高表达rPSA的X33细胞株。用不同浓度的甲醇进行诱导表达，进一步摸索诱导表达的最适甲醇浓度。1.5%的甲醇浓度进行摇瓶培养，回收培养液，经Amicon超虑器进行超滤，阳离子交换层析纯化rPSA，经SDS－PAGE、Western-Blot鉴定PSA蛋白，应用S－2586检测rPSA酶活性。通过以上工作，获得了PSA cDNA序列，且与gene bank一致。构建了pGEM－PSA质粒（含有PSA全长），pGEM－mPSA质粒（酶切位点和酵母识别位点）。在此基础上，构建了表达载体pPICZα－mPSA，并且成功整合进入酵母染色体，甲醇诱导成功表达出成熟人重组PSA。ELASA试剂盒筛选出高表达rPSA蛋白的X33细胞株，命名为X33＃6。初步摸索了毕赤酵母的培养条件，发现诱导表达的最适甲醇浓度为1.5％。1.5％甲醇诱导培养，收集培养液上清，超滤浓缩，阳离子交换层析得到纯化的rPSA蛋白。经SDS-PAGE、Western Blot 鉴定表达的目的蛋<WP=90>白为人PSA，其产量约为1.2mg/L；在不同反应条件下，在3.5h内，酶活性与时间成正比；与正常精浆比较，rPSA活性显著高于正常精浆PSA酶活性。本研究得出如下几点结论，本实验获得的酵母X33＃6细胞株能够成功表达人前列腺特异性抗原,表达量为1.2mg/L；诱导表达的最适甲醇浓度为1.5％；阳离子交换层析方法可以纯化酵母表达产物rPSA；本实验获得的rPSA具有类胰凝乳酶活性，活性反应的最适温度为30℃；本实验获得的 rPSA的酶活性显著高于正常精浆的PSA酶活性。本实验应用毕赤酵母表达有活性天然PSA，毕赤酵母作为简单的真核细胞，可以在简单的培养基中生存，费用低廉，由于PSA基因整合进入酵母染色体中，不需要在培养基中加入抗生素，可以进一步降低成本，适合工业化生产；我们采用的煮－冻－煮的方法破坏酵母细胞壁，获得酵母基因组DNA，经PCR鉴定，证实编码PSA成熟肽的基因整合进入酵母染色体。该方法较invitrogen公司推荐的酵母DNA提取方法简单，并且不用消解酶 Zymolyse,降低实验成本，而且通过这种方法可以大批量制备DNA模板，进行PCR鉴定，可大大加快筛选过程。有报道提出毕赤酵母的一个优点是，在适量甲醇浓度下，AOX1启动子调控细胞转录的水平比过量的甲醇高3－5倍，从而降低了甲醇代谢的耗氧量，减少了对外源蛋白表达的影响。我们采用不同浓度的甲醇进行诱导，发现1.5％甲醇浓度能够使表达量提前达到高峰，PSA蛋白亦不出现降解。依据PSA的等电点，我们选择了阳离子交换层析的方法纯化蛋白，通过Wester-Blot 证实纯化得到的蛋白为PSA蛋白。PSA具有类胰凝乳蛋白酶的活性，我们应用胰凝乳蛋白酶特异性底物S-2586检测rPSA是否具有酶活性，参考文献报道，我们采用了最佳的pH值，并在反应体系中加入能够增强PSA酶活性的物质，在21℃、30℃和37℃条件下，在3.5h<WP=91>内rPSA的酶活性与时间成线性关系，表明rPSA具有类胰乳蛋白酶活性，并且我们发现最适的酶反应温度为30℃；与正常精浆做进一步比较，实验中得到的rPSA酶活性显著高于正常精浆PSA的酶活性。通过本研究的初步摸索，应用毕赤酵母表达体系大规模生产rPSA将成为可能，进一步体外研究PSA的生物学特征、各种临床鉴测和治疗代谢奠定了?