核酸检测一体化微流控系统的前处理关键技术研究

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核酸检测作为体外诊断中重要的检测方法,是许多病原菌的检测的金标准,但是由于传统的核酸检测涉及到不同的生化反应过程,需要专业的检验人员使用不同的仪器在专业的实验室内完成,往往耗时费力。因此,本文基于微流控技术开发了集成有细胞裂解,核酸提纯,扩增及检测的一体化核酸检测系统,重点研究了微流控芯片上的核酸检测前处理技术,主要工作内容和结论如下:(1)分析和对比了多种不同的样品前处理方法,设计了基于化学裂解和磁珠法作为样品前处理的核酸检测一体化微流控芯片,并分析了磁珠微团在芯片通道内转移过程中通过毛细被动阀时各个阶段毛细力的变化。(2)根据芯片结构对仪器功能进行分析,对整机进行结构设计,设计了一系列组件,包括一体化卡盒组件,试剂释放组件,主驱动组件,温度控制组件,永磁体阵列组件,荧光检测组件,构建了核酸检测一体化仪器的样机。(3)通过理论分析建立了包含磁珠的液滴力学模型,借助有限元仿真工具对磁珠微团所处的磁场环境进行了仿真,得到不同体积磁珠微团在不同位置所受的磁力,分析了磁珠微团体积、液滴体积、永磁体移动速度对液滴运动状态的影响,得到了液滴体积,永磁体运动速度和磁珠微团体积之间的匹配关系,总结出液滴操纵图。(4)通过灰度值分析法对磁珠微团转移过程中携带的液体进行了量化分析,估算出从裂解池中携带到扩增池的液体量小于0.1%,对扩增反应无影响;使用称重法对磁珠的回收率进行了分析,结果表明,芯片上的磁珠回收率略低于手动法,但是一致性好于手动法,且耗时更短;最后分析了不同振动频率对液滴混合的影响,结果表明在振幅为20mm时,2Hz的振动频率混合效果最好。(5)针对所开发的核酸检测一体化微流控系统,进行了一系列实验进行评估,其中芯片上核酸提纯实验证明了提纯率超过55%,达到了合理水平;芯片上对四种病原菌进行的多目标物核酸检测结果表明,四种病原菌都得到了扩增,且无交叉感染情况的发生,证明了该系统的有效性;通过试剂盒中的阳性对照物确定了检测下限为102copies/sample,证明了该微流控芯片可对初始样本的核酸含量进行定量分析。
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