本论文以我国北方沿海重要的珍贵经济养殖品种刺参（Apostichopusjaponicus）为研究对象，在室内循环养殖水系统进行摄食生长实验，以探究饲料中添加益生菌（马氏副球菌（Paracoccus marcusii DB11）、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus G19)）和抗生素（氟苯尼考）对刺参生长、肠道组织结构、肠道菌群组成、非特异性免疫及其相关基因表达的影响，在此基础上探讨刺参肠道细菌微生物网络响应益生菌和抗生素投喂，肠道组织和体腔细胞非特异性免疫的调控机制及两者之间的联系。本文的研究内容和主要研究结果如下:　　1、益生菌和抗生素对刺参生长、消化及肠道组织结构影响的比较研究　　本研究旨在探究饲料中添加马氏副球菌(P.marcusii DB11，109 cfu/kg-d)、蜡样芽孢杆菌（B.cereus G19，109 cfu/kg-d）和氟苯尼考（15 mg/kg，施药5d后停药15d，20 d一个周期）对刺参（初重，4.68±0.36 g）的生长、消化和肠道组织结构的影响以及三者之间的相互联系。每个处理分别设置5个重复，以投喂未添加上述任何成份的基础饲料组作为空白对照，养殖实验周期为60 d。实验结果表明，在马氏副球菌组和蜡样芽孢杆菌组刺参的特定生长率显著性高于对照组（P＜0.05），氟苯尼考组刺参的生长与对照组不存在显著性差异(P＞0.05)。刺参的生长与营养物质的消化和吸收紧密联系。研究结果显示，马氏副球菌组中粗蛋白表观消化率最高，显著高于蜡样芽孢杆菌组和对照组(P＜0.05)，而其在蜡样芽孢杆菌组和氟苯尼考组均与对照组不存在显著性差异(P＞0.05)。在光学显微镜水平条件下可以观察到，蜡样芽孢杆菌组刺参中肠皱褶高度和微绒毛高度均显著高于对照组(P＜0.05)，肠道的吸收表面积显著性增加，进而有效增强肠道对营养物质的吸收;氟苯尼考组的肠道内微绒毛高度显著性低于对照组（P＜0.05），吸收面积骤降。通过电镜观察发现，马氏副球菌组微绒毛表面存在大量粘液，而氟苯尼考组刺参肠道内的微绒毛大幅萎缩，肠上皮细胞甚至出现凋亡现象，该结果表明氟苯尼考的频繁使用可能会增加病原菌的入侵的风险。　　2、益生菌和抗生素对刺参非特异性免疫指标影响的比较研究　　高密度养殖过程中病害频发，抗生素大量被使用，引起水产动物免疫力下降，导致存活率降低。而益生菌日常使用不仅可以促进水产动物的生长，还可以增强其免疫力而提高存活率，现已被广泛应用于水产养殖。本研究旨在比较饲料中添加益生菌（马氏副球菌（P.marcusii DB11）和蜡样芽孢杆菌(B.cereus G19))和抗生素（氟苯尼考）对刺参体腔细胞非特异性免疫的影响，测定的指标包括:吞噬活性、呼吸爆发、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)。实验结果表明，投喂马氏副球菌可以显著性提高刺参体腔细胞的吞噬活性、呼吸爆发和超氧化物歧化酶活性（P＜0.05）;投喂蜡样芽孢杆菌显著性提高了刺参体腔细胞的吞噬活性、呼吸爆发和碱性磷酸酶活性（P＜0.05）;而投喂氟苯尼考的刺参体腔细胞的呼吸爆发能力显著性低于对照组（P＜0.05），但溶菌酶活力显著性高于对照组(P＜0.05);刺参体腔细胞的酸性磷酸酶不受饲料变更的影响（P＞0.05）。综上所述，投喂马氏副球菌和蜡样芽孢杆菌可以显著性提高刺参的非特异性免疫力，而氟苯尼考组是截然相反的结果。　　3、饲喂益生菌和抗生素刺参体腔注射灭活灿烂弧菌前后相关免疫基因表达的比较研究　　研究证明饲料中添加益生菌（马氏副球菌（P.marcusii DB11）和蜡样芽孢杆菌（B.cereus G19））可以有效提高刺参的非特异性免疫，而抗生素（氟苯尼考）会降低刺参的非特异性免疫，但具体的免疫调节机制仍不清楚。本文通过研究刺参肠道中肠组织NF-κB信号通路中Aj-p105、Aj-p50和Aj-rel三个转录因子基因和溶菌酶基因Aj-lys mRNA表达来探究马氏副球菌、蜡样芽孢杆菌和氟苯尼考调节刺参非特异性免疫的机制，以及刺参体腔注射灭活灿烂活菌后上述4个免疫基因在体腔细胞中的表达情况，从分子转录水平反映益生菌和抗生素刺参抗病力的影响。研究结果显示，在刺参肠道组织中，投喂马氏副球菌显著提高了Aj-p105、Aj-p50和Aj-lys mRNA的表达（P＜0.05），增幅分别为50％、49％和47％;投喂蜡样芽孢杆菌对Aj-p105、Aj-p50和Aj-rel mRNA的表达没有显著影响（P＞0.05），但Aj-lys mRNA的表达显著性低于对照组（P＜0.05），仅为对照组的54％;投喂氟苯尼考显著性抑制了肠道组织中Aj-p50、Aj-rel和Aj-lys mRNA的表达（P＜0.05)，表达量分别为对照组的62％、32％和37％。刺参体腔注射灭活灿烂弧菌后，四个处理组体腔细胞Aj-p105 mRNA的表达24 h内均大幅下降，最终趋于平稳;Aj-p50 mRNA在蜡样芽孢杆菌组表达量急剧增加并在第24 h首先达到峰值，而其余三个处理组在第72 h达到峰值，随后全部下降并趋于平稳;在0到24 h，Aj-rel mRNA的表达在蜡样芽孢杆菌组的表达均显著性高于对照组，而其在马氏副球菌组和氟苯尼考组的表达在第24 h时显著高于对照组;Aj-lys mRNA在对照组和氟苯尼考组的表达均是的先上升后下降，分别在第24 h和72 h处达到峰值，其在蜡样芽孢杆菌组的表达在24 h后持续大幅增加，并在第7d显著性高于其它三个处理组（P＜0.05）。上述研究结果表明，马氏副球菌可以通过调节免疫基因Aj-p105、Aj-p50和Aj-lys mRNA来提高刺参肠道非特异性免疫。在注射灭活灿烂弧菌后，蜡样芽孢杆菌组刺参体腔细胞的Aj-p50 mRNA表达迅速达到峰值表明，投喂蜡样芽孢杆菌可能通过调控NF-κB信号通路中转录因子的表达来调节刺参的非特异性免疫，使其在更短的时间内对入侵的病原菌作出应激反应，然后再通过分泌溶菌酶进一步清除病原菌。　　4、益生菌和抗生素对刺参肠道菌群结构影响的比较研究　　通过Illumina MiSeq高通量测序平台测定了细菌16S DNA V3-V4区来研究刺参肠道细菌微生物群落组成及物种之间的相互作用响应日粮中添加马氏副球菌(P.marcusii DB11)、蜡样芽孢杆菌（B.cereus G19）和间歇添加氟苯尼考，以投喂未作添加的基础饲料的刺参作为对照组。研究结果显示，在门分类水平上，刺参肠道内的细菌分布在36个不同的细菌类群，主要由变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)组成。在纲分类水平上，四个处理组的刺参肠道内的优势菌群均为黄杆菌纲(Flavobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和α-变形菌纲，但在各处理组中的相对丰度存在差异。它们在对照组中的相对丰度依次为49％、18％和16％。黄杆菌纲在对照组中是第一优势菌群，它的丰度在其它三个处理组都有不同程度的下降，主要是黄杆菌科(Flavobacteriaceae)细菌的丰度下降引起。马氏副球菌组的疣微菌纲(Verrucomicrobiae)（主要是疣微菌Verrucomicrobiaceae）的丰度大幅增加（从5％增至14％），同时黄杆菌纲的丰度大幅下降（降至29％，第一优势菌群）;蜡样芽孢杆菌组中的α-变形菌纲(主要是红菌科Rhodobacteraceae)成为第一优势菌群（增至36％），然而黄杆菌纲的丰度急剧下降（降至15％）;氟苯尼考组中γ-变形菌纲（主要是弧菌科Vibrionaceae）增至27％，成为第一优势菌群，同时疣微菌纲的丰度也大幅增加（从5％增至12％），而黄杆菌纲的丰度下降至16％，此外氟苯尼考组的细菌多样性指数最低。基于Uniffac和非Unifrac权重的PCoA分析结果显示，马氏副球菌组、蜡样芽孢杆菌组和氟苯尼考组刺参的肠道菌群结构均与对照组发生明显分异。生态网络分析结果表明，饮食可以通过改变刺参肠道细菌微生物群落组成和OTU在网络图中的拓扑角色来影响两个不同功能微生物种群之间的相互作用，同时肠道细菌微生物生态网络组成与肠道菌群结构组成相似。对照组刺参肠道细菌微生物的生态网络由主要由22个子模块(sub-module)构成，包含563个OTUs和1552条连线，其中有4个OTUs分别属于连接器（Connectors，3个）和模块枢纽（Module hubs，1个），同时，各个子模块之间联系紧密。连接器和模块枢纽在整个生态网络中承担着不可不可或缺的作用。马氏副球菌组生态网络主要由5个大型的子模块构成，包含682个OTUs和5517条连线，属于连接器（7个）和模块枢纽（5个）的OTUs数量增至12个，OTUs之间和子模块之间联系在四个处理组最紧密。蜡样芽孢杆菌组的生态网络主要由18个子模块构成，包含665个OTUs和1582条，属于连接器（1个）和模块枢纽（11个）的OTUs数量也增至12个。在氟苯尼考组的生态网络主要由15个子模块构成，包含462个OTUs和1508条连线，仅有一个OTUs属于连接器，该生态网络的系统功能已经崩溃。此外，研究还发现刺参肠道中的第一优势菌群在其生态网络中承担着重要角色。