论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是单股负链DNA病毒,直径约17 nm,是现阶段最小的动物病毒。由PCV2病毒引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)发病迅速,流传广泛,病猪难以治愈且死亡率高,对国内乃至全世界的养猪业危害极大。PCV2常常与某些病毒混合感染,如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、弓形体、附红细胞体等,可促进相关疾病的发作。PMWS典型症状包括进行性消瘦,呼吸困难,厌食,精神不振,毛发蓬乱,黄疸等。肉眼检查肠系膜及腹股沟淋巴异常肿大和肺部灰褐色炎症病变最常见,其它一些器官如肝、脾、胰、胃、小肠和结肠也常见肿大及坏死病变。由于PCV2严重破坏猪的免疫系统,引起免疫力低下,一旦猪体内存在其他病毒或细菌、原虫感染,就会暴发流行,目前该病已广泛流行于美国、法国、中国、韩国等国家,给世界各国养猪业造成的损失巨大。目前,PCV2的诊断主要依靠免疫学检测技术和分子生物学检测技术。但是这些检测方法普遍存在一定的局限性,灵敏度低、成本高、操作过程复杂等因素都限制了检测技术的应用。因此,需要开发出一种快速、简便、灵敏和精确的方法检测PCV2病毒。本实验室已开发出猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒,本试验拟进一步对该试剂盒进行原材料的研究、工艺及反应体系的研究和分析性能研究,使试剂盒各方面反应条件达到最优化,提高试剂盒的检测性能,并进行PCV2 LAMP现场可视化定性检测试剂盒的药证初步申报工作,为该试剂盒药证申报打下基础,为其他相关现场可视化检测技术的药证申报提供参考。主要内容及结果如下:1.猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒主要原材料的研究本研究旨在对猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒进行主要原材料的研究。根据GenBank公布的PCV2 CP序列,利用PrimerExplorer V5在其保守序列区域设计了 LAMP引物,优化各反应条件,建立了对PCV2病毒进行减少污染,减少现场操作步骤的DNA扩增的LAMP试剂盒试剂吹干工艺,并对试剂盒进行Bst酶和LAMP反应缓冲液的比对研究、Bst酶和LAMP反应缓冲液质量鉴定研究、试剂盒阳性参考品研究和试剂盒阴性参考品研究。该方法在61℃恒温下作用40 min,PCV2病毒DNA获得了高效率的特异性扩增。本试验选择了 A、B、C三家生物科技有限公司的Bst酶和LAMP反应缓冲液进行比对研究与质量鉴定研究,结果表明:B生物科技有限公司的试剂较好,选择该厂家的原材料可实现试剂盒检测性能的最大化。试验中对试剂盒阳性参考品进行梯度稀释研究,结果表明本实验的灵敏度高;对试剂盒阴性参考品—猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)进行研究,结果表明本实验的特异性较好。本工作为猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒药证申报初步工作打下一定基础,为诊断猪圆环病毒2型提供准确可靠工具。2.猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒工艺及反应体系的研究本研究旨在对猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒进行工艺及反应体系的研究。根据GenBank公布的PCV2 CP序列,利用PrimerExplorer V5在其保守序列区域设计了 LAMP引物,优化各反应条件,建立了检测PCV2病毒的LAMP试剂盒试剂吹干工艺,并对试剂盒进行样本储存时间研究、样本冻融次数研究、样本运输储存时间研究、试剂用量研究、试剂盒灵敏度研究和特异性研究等。该方法在61℃恒温下作用40 min,PCV2病毒DNA获得了高效率的扩增。本试验将PCV2病毒临床阳性样本分别置于2-8℃、-20℃、-70℃条件中,间隔一段时间进行检测以确定样本的有效期。试验中采用PCV2阳性样本,设计冻融次数分别为1次,3次,5次,7次,9次,结果建议样本的冻融次数不超过5次;采用PCV2阳性样本并模拟室温条件下的运输条件,结果建议样本的运输时间不超过4天。对试剂盒进行特异性和灵敏度进行评价,结果表明本实验的特异性较好,灵敏度高,可达到2拷贝/uL。同时也对实验的外部环境及体系用量进行了研究,结果表明本研究建立的检测方法受外界环境影响较小。本工作为猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒药证申报初步工作打下一定基础,为诊断猪圆环病毒2型提供准确可靠工具。3.猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒分析性能研究本研究旨在对猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒进行分析性能研究。根据GenBank公布的PCV2 CP序列,利用PrimerExplorer V5在其保守序列区域设计了 LAMP引物,优化各反应条件,建立了对PCV2病毒DNA进行特异扩增的LAMP试剂盒试剂吹干工艺,研制LAMP检测试剂盒,并对试剂盒进行灵敏度、特异性、准确性、干扰物质研究等。该方法在61℃恒温下作用40 min,PCV2病毒DNA获得了高效率的扩增。本试验将PCV2质粒梯度稀释取104、103、102、101、5、2、1七个梯度,结果表明该检测技术可达到2拷贝/uL。实验采用猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)进行特异性研究,结果表明本实验的特异性较好。实验取临床已知样本进行准确性评估,实验结果表明该检测技术具有较高的准确性。采用PCV2病毒培养液与血液、血清样本混合,结果表明血液、血清对PCV2阳性样本的检测没有干扰。实验取金霉素、土霉素、阿莫西林等抗生素药物加入到反应试剂中,结果表明选取的抗生素等药物对试剂盒的检测不存在干扰。本工作为猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP现场可视化快速检测试剂盒药证申报初步工作打下一定基础,为诊断猪圆环病毒2型提供准确可靠工具。