脑胶质瘤(glioblastoma,GBM)是目前已知的恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤。常为原发性,在成人多见。同时也是颅内出现率最高的恶性肿瘤,约占80%。神经胶质细胞多为其来源,属于病死率和致残率都较高的恶性肿瘤,预后极差。尽管目前采取了多种治疗方法,即以手术治疗为主,辅以化学治疗,放射治疗及生物治疗等方法,而且随着神经影像学和神经外科手术技术的提高,现状有所改善,然而,恶性胶质瘤的治疗效果仍很不理想,预后不佳。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是化学治疗药物,属于口服二代烷化剂的一种。其对各种实体性肿瘤治疗效果显著,目前已成为胶质瘤化疗的首选一线治疗药物。TMZ同步放疗联合辅助化疗是新诊断胶质瘤的标准治疗方案。但即便如此,脑胶质瘤的化疗效果仍然有限。究其原因,第一,可能是血脑屏障的存在影响了药物在脑中的分布和吸收。第二,可能是肿瘤耐药基因的存在。因此肿瘤细胞对TMZ敏感性下降,产生耐药,从而造成肿瘤进展或复发,仍然是TMZ化疗失败的主要原因。与胶质瘤内在或获得性耐药的相关基因中,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)是目前相关研究中,发挥重要作用的一员,可以修复由烷化剂引起的DNA损伤,从而导致肿瘤对TMZ和BCNU等化疗药引起的DNA损伤减轻,从而导致耐药性。MGMT启动子甲基化,通过表观遗传学修饰,使MGMT基因沉默,从而增加肿瘤对烷化剂治疗的敏感性机制已得到了广泛认可。还有研究显示MGMT启动子甲基化与IDH的状态和全基因组表观遗传变异(G-CIMP表型)密切相关。寻找能够影响MGMT表达的相关基因或机制,从而进一步增强TMZ治疗效果,成为一个被关注的方向和热点。NDRG2基因属于一个抑癌候选基因,在1999年通过消减杂交法被发现。在许多系统均见其与肿瘤发生发展有关,如肺癌,结肠癌,乳腺癌,胃癌等等。在恶性胶质瘤细胞系中,也发现NDRG2表达明显下降,同时体外外源性过表达NDRG2能够抑制抑制胶质瘤增殖。随后还在脑膜瘤中发现NDRG2下调。NDRG2启动子甲基化,被认为与NDRG2转录水平下降呈高相关性。除了NDRG2启动子高甲基化,NDRG2还通过上调组蛋白乙酰化来调控胶质瘤生长。NDRG2表达水平与脑肿瘤病理分级呈负相关,与星形胶质细胞瘤病人的生存率呈正相关。对于NDRG2与MGMT之间关系,目前尚不清楚,亦鲜见相关文献报道,缺乏相关基础工作,我们的研究可以为提高TMZ治疗脑胶质瘤敏感性,探索与其相关的新的协同因子,增强其治疗效果,改善病人预后提供新的方向和策略。基于以上既往研究结果,我们探求NDRG2基因是否在脑胶质瘤患者的TMZ化疗过程中发挥作用,是否与MGMT相关,其又扮演何种角色,通过什么机制产生?为解析这些科学问题,我们开展了以下研究。【目的】1.明确NDRG2与脑胶质瘤TMZ化疗疗效的相关性。2.探索NDRG2促使脑胶质瘤对TMZ化疗药物敏感性增加的因素。3.解析NDRG2调控MGMT的分子信号通路。4.在TMZ耐药脑胶质瘤细胞中阐明NDRG2与MGMT关系。【方法与结果】1.NDRG2增强TMZ对脑胶质瘤的敏感性(1)构建NDRG2过表达和对照组Cherry细胞系选用p Lenti6.3/V5-DEST慢病毒表达载体,成功构建了U87-NDRG2细胞,U87-Cherry细胞,A172-NDRG2细胞,A172-Cherry细胞,T98G-NDRG2细胞,T98G-Cherry细胞,U251-NDRG2细胞,U251-Cherry细胞。同时利用q RT-PCR检测NDRG2的m RNA表达情况,利用Western blot检测NDRG2蛋白表达情况。(2)NDRG2促进TMZ对脑胶质瘤的治疗敏感性前期研究显示NDRG2对脑胶质瘤细胞具有抑制其增殖的现象,那么在使用TMZ后的趋势如何,有无其他变化?NDRG2过表达是否增强TMZ对脑胶质瘤的杀伤能力?我们从测定细胞生长及杀伤曲线,检测细胞周期和凋亡指标等方面评价。通过实验,检测MTT指标,观察细胞生长趋势。结果发现:在U87细胞中,在给予TMZ,时间持续24h的条件下,细胞的相对生长活力随着加入TMZ浓度的增加而降低,但这个现象局限于0-400umol/L的浓度范围内,在400-800umol/L的浓度范围内,曲线开始变得平坦,提示到达一定程度后,浓度不再成为影响细胞活力的主要因素。同时观察到NDRG2组的相对细胞活力较Cherry组降低。在加入TMZ,浓度为400umol/L,持续5天的MTT检测发现:加药后NDRG2过表达组的相对生长活力显著低于Cherry细胞。在给予TMZ处理24h后,我们观察到在U87细胞中,不论是加药组,还是未加药的对照组,NDRG2过表达组的凋亡率都明显高于Cherry组。并且加药组的凋亡率明显高于对照组。在T98G细胞中,亦观察到同样的趋势。接着,我们给予不同浓度的TMZ,作用于U87细胞,在一定范围内,发现随着给药浓度的升高,凋亡率也有随之上升的趋势。NDRG2过表达组的凋亡率高于Cherry组。在前期的工作中,我们课题组在观察流式细胞仪检测结果时,曾发现NDRG2过表达能够影响细胞周期。在加入TMZ后,细胞周期的分布情况结果发现:NDRG2过表达组与对照组相比,G1期比率增高,但加入药物及药物浓度的不同并未发现对周期有明显的影响。该部分实验提示NDRG2能够提高TMZ对脑胶质瘤的敏感性,使细胞增殖能力下降,凋亡率增高。2.NDRG2通过阻碍MGMT上调使TMZ疗效增强(1)不同胶质瘤细胞中NDRG2、MGMT及NF-κB表达在第一部分我们发现在使用TMZ药物作用的情况下,NDRG2过表达能够显著提高TMZ对细胞的杀伤作用,抑制脑胶质瘤的生长,促进其细胞的凋亡。那么NDRG2是通过何种机制来产生这种作用的呢?众所周知,MGMT是一个与TMZ治疗胶质瘤产生用药抵抗乃至耐药关系密切的基因,它能修复TMZ造成的DNA损伤。在正常的人体及动物组织中,MGMT能起到保护作用,避免烷化剂损伤,阻止癌症产生,在肿瘤组织中,也避免烷化剂类化疗药物损伤,就会出现耐药。因此,我们设想:NDRG2是否通过调节MGMT的表达来影响TMZ对脑胶质瘤细胞的疗效?于是我们进行了相关实验,目的在于观察TMZ作用于脑胶质瘤细胞后,MGMT的表达变化情况与NDRG2的关系。我们观察了U87、T98G、U251、A172这几个细胞系中NDRG2和MGMT的本底表达情况。结果发现在T98G细胞中内源性MGMT表达明显,而U87、U251、A172细胞系MGMT表达极低,甚至观察不到。(2)U87和T98G分别加入TMZ后MGMT的m RNA及蛋白表达在U87细胞中,Cherry组加入TMZ后MGMT表达升高,NDRG2组加入TMZ后MTMT表达略有升高。但在加入TMZ后,我们可以明显地观察到NDRG2组MGMT表达较Cherry组降低。在T98G,U251及A172细胞中我们可以观察到同样的现象。因此,我们认为NDRG2在TMZ给药情况下的脑胶质瘤中可能阻碍MGMT的表达上调。3.NDRG2调控MGMT的机制研究NDRG2在甲基化水平对MGMT的调控观察在观察到NDRG2与MGMT之间存在相关性的前提下,我们关注NDRG2与MGMT之间是通过何种通路介导。既往研究显示MGMT启动子甲基化是MGMT表达活性下降的一个重要原因。因此我们首先从甲基化的角度研究了NDRG2是否通过促进MGMT甲基化水平提高,从而减低MGMT表达活性,增加脑胶质瘤对TMZ的敏感性。NDRG2也可以通过抑制PI3K/AKT通路来抑制肿瘤细胞的发生发展,还曾有文献报道NF-κB可能是MGMT介导的烷化剂耐药过程中的主要作用因子。故我们从这几个方面去探寻NDRG2调控MGMT的介导路径。我们利用甲基转移酶抑制剂GSK343处理细胞,它能够与SAM竞争,选择性地抑制EZH2,是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂,EZH2的高表达或者EZH2的突变曾在许多癌症中被发现,显示出EZH2是治疗癌症的一个可能靶点。可以看到:在未加TMZ情况下,MGMT表达受GSK343影响而升高;在加入TMZ情况下,MGMT在NDRG2组和对照组中均升高,但加入GSK343时两组并无明显差异。说明:NDRG2可能不是通过GSK343这条甲基化途径发挥作用。5-AZA属于DNA甲基转移酶抑制剂,在TMZ存在的情况下,NDRG2如果通过甲基化MGMT使其失活表达下降,使用甲基化抑制剂后MGMT下降趋势应该减少,但实验结果并非如此,表明可能不是通过该途径发挥作用。(2)NDRG2在AKT通路与MGMT的调控观察既往曾有研究者发现NDRG2可以通过抑制AKT通路来抑制肿瘤细胞的发生发展,我们分别在U87和T98G细胞中,设立NDRG2过表达组和相应对照组,观察AKT和p-AKT蛋白表达情况。结果并未发现显著性差异。目前没有发现证据支持NDRG2通过AKT通路影响MGMT。(3)NDRG2在NF-κB通路对MGMT的调控观察在我们所采用的脑胶质瘤细胞U87和T98G中,可以观察到在Cherry组,加入TMZ后MGMT明显升高,在NDRG2组,加入TMZ后MGMT亦有所上升。但观察比较加入TMZ的Cherry组及NDRG2组,可以看到NDRG2组的MGMT较Cherry组低。p-p65(磷酸化的NF-κB亚基p65)也显示了同样的趋势。TNF-α可以刺激NF-κB的表达,在U87和T98G细胞中可以观察到在加入TNF-α后,MGMT的表达较加药前明显上升。JSH-23属于NF-ΚB转录活性抑制剂,在U87和T98G细胞中可以观察到在加入JSH-23后,MGMT的表达较加药前明显下降,且与p-p65的变化趋势基本一致。从一定程度上说明MGMT可能受到NF-κB通路的正向调控。4.TMZ耐药细胞中NDRG2与MGMT的表达情况U251耐药细胞与亲本细胞进行生长曲线的比较,发现随着时间向前推进,耐药细胞U251的增殖能力明显高于亲本细胞,说明耐药细胞的增殖速率变快,恶性程度更高。U251耐药细胞与亲本细胞相比,在给予TMZ的情况下,随着TMZ药物作用浓度的增高,其杀伤效率出现了明显的差异,耐药细胞组明显低于亲本组。说明耐药细胞对TMZ抵抗性更强,治疗效果会变差。U251耐药细胞中MGMT表达明显上升,NDRG2表达下降。在给予TMZ作用后,耐药细胞中NDRG2组的MGMT可以观察到表达下降,也从另一个角度印证了NDRG2增强U251耐药细胞药物敏感性是通过调控MGMT而实现的。【结论】通过本课题以上的研究内容和结果,发现NDRG2可能阻碍TMZ使用后MGMT上调,来提高TMZ治疗脑胶质瘤的敏感性,这一过程可能通过NDRG2抑制NF-κB信号通路继而阻碍MGMT上调来实现。但未发现该过程与AKT通路有关,亦未发现其依赖于MGMT甲基化。