基于单颗粒检测技术和血小板膜包被纳米颗粒的纤维蛋白原定量分析

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纤维蛋白原在众多生理过程中发挥着重要作用同时也是多种疾病的生物标志物。因此,其定量分析方法的开发尤为重要。目前存在的纤维蛋白原测定方式普遍存在着影响因素多、灵敏度低、选择性差、修饰物昂贵且过程复杂等局限性。因此,开发能解决上述问题的新型纤维蛋白原定量分析方法有一定的研究意义,并有望为不同疾病的早期诊断、预后和治疗效果评估提供新思路。近年来,基于单分子显微成像技术的单颗粒检测由于其高通量、高灵敏度和超低样品消耗等优势被广泛应用于各种生物分子的定量分析。因此,本研究创新性结合单颗粒检测技术和细胞膜包被纳米技术,将血小板膜包被纳米颗粒(Platelet membrane-coated nanoparticles,PNPs)作为探针,建立了一种基于荧光共定位分析的高灵敏纤维蛋白原检测方法。由于血小板膜上整联蛋白αIIbβ3和目标物纤维蛋白原的特异性结合,荧光发射波长不同的两种PNPs在纤维蛋白原的存在下会形成聚集结构,从而导致叠加通道图像中的荧光共定位现象。因此,根据荧光共定位程度(使用皮尔森相关系数量化)可对纤维蛋白原进行定量分析。本文的主要工作内容包含以下几个部分:(1)采用差速离心法从全血中提取出了血小板,并用反复冻融法实现了血小板膜的分离。运用脂质体挤压器将血小板膜囊泡包裹在两种聚苯乙烯荧光微球表面,制备出了大小均一、分散良好且性质稳定的PNPs。(2)将具有红色荧光发射的PNPs和绿色荧光发射的PNPs作为探针,对缓冲液体系中的纤维蛋白原进行了定量检测。本文验证了方法的可行性、优化了实验条件并实现了纤维蛋白原的高灵敏检测。最终实验结果表明此方法的检出限低至3.9μg/m L(11.3 n M),线性范围为30-300μg/m L。不仅如此,使用该方法检测多种非标干扰物质,均无明显响应。证明本文构建的方法具有较高的选择性。(3)本研究通过血浆样品的加标回收实验探究了检测方法的实际应用潜力和稳定性。结果表明,加标回收率为98.3%-105.5%。证明此纤维蛋白原测定方法的重复性较好,具有稳定的检测能力。综上所述,本文提出了一种基于单颗粒检测和细胞膜包被纳米技术的纤维蛋白原定量方式,有机结合了两种新技术的优势,在一定程度上解决了现有方法存在的问题。结果表明,该技术有望应用于实际血浆样品中纤维蛋白原的定量分析。
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