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目的:中国的新发癌症人数及癌死亡人数均居世界第一,乳腺癌取代肺癌已成为世界第一高发癌。吉西他滨（Gemcitabine,2’,2’-difluorodeoxycytidine,d Fd C）作为水溶性的胞嘧啶核苷酸衍生物,是细胞周期特异性抗代谢药物,其三磷酸盐形式与DNA结合时能够有效阻止脱氧核苷酸合成DNA,抑制肿瘤细胞中DNA的合成,从而抑制DNA链的延长,是临床上复发转移乳腺癌患者常用的化疗药物。吉西他滨发挥作用依赖于磷酸化限速酶脱氧核苷激酶（deoxycytidine kinase,d CK）活性。d CK作为吉西他滨细胞内代谢的主要限速酶,在化疗耐药中的作用已逐渐被揭示,多项体内外实验均证实d CK活性与吉西他滨敏感性正相关。黑腹果蝇多底物脱氧核糖核苷激酶（multisubstrate deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster,Dm-dNK）是目前研究较多的自杀基因之一,其可与细胞内的激酶共同磷酸化活化核酸类似物例如吉西他滨,然后通过DNA复制转录掺杂入DNA或RNA链中,引起细胞凋亡。Dm-dNK较普通的脱氧核糖核苷酸激酶有如下优点:1、具有更广泛的底物特异性,能有效的磷酸化部分天然脱氧核糖核苷酸及临床上可用的核苷类似物;2、更高的催化效率。前期关于Dm-dNK作为自杀基因联合多种核苷类似物的研究,在多种肿瘤细胞中均取得了明显的肿瘤杀伤效果。鉴于d CK与Dm-dNK作用的相通性,本研究旨在探讨Dm-dNK潜在的逆转吉西他滨耐药作用,并对其机制进行初步探索。研究方法:在第一部分研究中,我们采用低浓度梯度递增的方法构建了吉西他滨耐药的各类型乳腺癌细胞系,定义为MDA-MB-231R,MCF-7R,SKBR-3R。MTT实验观察比较了各细胞系的细胞抑制率。各耐药细胞系感染携带野生型Dm-dNK的慢病毒,MTT实验比较了各耐药细胞系感染Dm-dNK前后对吉西他滨的敏感性差异。在第二部分研究中,我们锁定耐药的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231R。我们将Dm-dNK的第247位精氨酸突变为丝氨酸,定义为Dm-dNK突变型（mutant type,Dm-dNKmut）。感染携带Dm-dNK或Dm-dNKmut的慢病毒后,Realtime-PCR（RT-PCR）和western blot技术检测评估Dm-dNK及Dm-dNKmut的转录及蛋白表达水平。DAPI染色检测Dm-dNK或Dm-dNKmut在细胞内定位,酶活性实验检测各组细胞酶活性。MTT实验比较MDA-MB-231R感染Dm-dNK或Dm-dNKmut后对吉西他滨的敏感性。Western blot检测比较了亲代和耐药细胞中耐药相关蛋白P-glycoprotein（P-gp）,cytidine deaminase（CDA）和d CK的表达水平,并比较了感染Dm-dNK或Dm-dNKmut前后P-gp蛋白表达水平变化,对乳腺癌细胞吉西他滨耐药的机制进行了初步的探索。流式细胞检测技术比较了MDA-MB-231R感染慢病毒空载体、Dm-dNK或Dm-dNKmut后各组的凋亡率。在第三部分研究中,我们按设定的比例将感染了Dm-dNK的乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231R及非转染细胞混合,MTT实验比较含有Dm-dNK的旁观者细胞生长分化抑制率,评估其旁观者效应。同样方法评估Dm-dNKmut的旁观者效应。将乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231R皮下注射到每个BALB/C裸鼠的右侧腋下,共分为5组,组1:d Fd C;组2:Lv-Dm-dNK+PBS;组3:Lv-Dm-dNKmut+PBS;组4:Lv-Dm-dNK+d Fd C;组5:Lv-Dm-dNKmut+d Fd C,分析比较各组肿瘤生长曲线。结果:在第一部分的研究中,我们通过体外低浓度梯度递增法成功构建了对吉西他滨耐药的乳腺癌细胞系MDA-MB-231R,MCF7R,SKBR-3R。各耐药细胞系对吉西他滨的敏感性较亲代细胞明显降低。各耐药细胞系加入慢病毒介导的Dm-dNK后,对吉西他滨的杀伤敏感性较亲代细胞明显增强。在第二部分的研究中,我们将Dm-dNK的第247位精氨酸突变为丝氨酸,发现Dm-dNKmut在RNA转录、蛋白翻译表达均与野生型Dm-dNK相似,但细胞定位不同,Dm-dNKmut蛋白表达于细胞浆,Dm-dNK表达于细胞核,且两者细胞内酶活性相似。MDA-MB-231R转染Dm-dNK或Dm-dNKmut后均可有效逆转细胞对吉西他滨的耐药,敏感性大幅增高,两者无明显差别。耐药细胞MDA-MB-231R较亲代细胞P-gp表达明显上调,CDA表达增强,d CK较正常细胞系中表达降低,有统计学差异。感染Dm-dNK或Dm-dNKmut后,P-gp表达水平均明显下降,凋亡率显著增加,在Dm-dNK和Dm-dNKmut组别间未见明显差异。在第三部分研究中,我们发现Dm-dNK及Dm-dNKmut在MDA-MB-231R中均可诱导吉西他滨杀伤的旁观者效应,增强周围未转染的耐药细胞对吉西他滨的化疗敏感性,虽然Dm-dNKmut旁观者效应在趋势上略强于Dm-dNK,但并无统计学差异。同时我们在成瘤裸鼠中验证了Dm-dNK及Dm-dNKmut在体内亦可成功逆转吉西他滨耐药的作用。结论:采用低浓度梯度递增的方法可构建吉西他滨耐药的各类型乳腺癌细胞系。Dm-dNK及Dm-dNKmut分别表达于细胞核及细胞浆,酶活性及磷酸化能力在耐药细胞株均可同等呈现。Dm-dNK及其突变型可通过增加吉西他滨磷酸化效率、提高凋亡率、降低P-gp等机制有效逆转乳腺癌细胞对吉西他滨耐药。Dm-dNK及Dm-dNKmut的旁观者效应可进一步提高其逆转吉西他滨耐药的效能。体内实验显示,Dm-dNK及Dm-dNKmut注射组应用吉西他滨后小鼠移植瘤体积明显缩小。