夜蛾科昆虫大多为农林重要害虫,化学杀虫剂的持续和大量使用,不但使害虫产生了不同程度的抗药性,而且引起的环境污染及农药残留等问题日益突出,亟待开发新型的无公害替代防治技术。目前,基于昆虫嗅觉调控的害虫防治策略已经在农业害虫和媒介昆虫的防治上得到运用,但相关的分子机制仍然不十分清楚。相比于其他昆虫,夜蛾科昆虫的成虫由于夜间活动,其性信息素通讯系统具有更高的灵敏性和种特异性,因此在两性间的交配和种群繁衍中起到更为重要的作用。性信息素结合蛋白(Pheromone-binding protein,PBP)和普通气味结合蛋白(General odorant-binding protein,GOBP)是鳞翅目昆虫特有的两类重要的气味结合蛋白(Odorant-binding protein,OBP)亚家族,传统观点认为前者参与性信息素分子的结合和运输,后者则和普通气味分子的感受有关。然而,在夜蛾科中,一种昆虫普遍存在3个不同的PBP基因和2个不同的GOBP基因,且这5个基因在不同种间具有很高的保守性。那么,夜蛾科PBP/GOBP在两个亚家族间及亚家族内不同成员间的进化关系如何?它们在功能上是否已产生明显的分化?回答这些问题,不仅有助于深入了解昆虫的嗅觉机制及其进化,而且可为设计和开发基于嗅觉调控的害虫防治新技术提供指导和潜在靶标。本研究以夜蛾科灰翅夜蛾属两种重要农业害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾Spodoptera litura为对象,综合利用分子生物学、生物信息学和生物化学等技术,对上述问题进行了较为深入的研究和分析。主要结果如下:1.两种灰翅夜蛾属昆虫化学感受基因的鉴定和表达谱分析根据已公布的甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同发育龄期的转录组,利用生物信息学和分子生物学技术,鉴定了两种灰翅夜蛾属昆虫中6类主要的化学感受基因家族。从甜菜夜蛾转录组中一共鉴定到79个化学感受基因,包括34个OBP、20个CSP、10个OR、6个GR、6个IR和3个SNMP;从斜纹夜蛾转录组中鉴定到80个化学感受基因,包括38个OBP、21个CSP、8个OR、4个GR、6个IR和3个SNMP。其中,首次在两种昆虫中鉴定到各一个新的鳞翅目SNMP,根据序列特征和进化分析命名为SNMP3,并在另外3种蛾类昆虫中得到验证。序列比对结果显示,两种昆虫的大部分同源的化学感受基因具有较高的氨基酸一致性(>80%)。进化树分析结果显示,两种昆虫各有3个Minus-C OBP和3个Plus-C OBP,其余均属于Classic OBP(包括PBP/GOBP、CRLBP、ABPⅠ和ABPⅡ)。RT-PCR结果表明,甜菜夜蛾被测试的67个化学感受基因至少在一个被测组织中表达,且大多数(约80%)基因在成虫触角或幼虫头部(含触角)有表达,暗示它们在嗅觉中起作用。2.两种灰翅夜蛾属昆虫PBP/GOBP的基因结构和进化分析基于鳞翅目昆虫已知PBP/GOBP的基因组DNA序列,通过生物信息学方法分析了25种鳞翅目昆虫的62个PBP/GOBP基因序列。结果表明,所有PBP/GOBP具有2个内含子和3个外显子,并且具有保守的内含子插入位点。针对夜蛾科昆虫PBP/GOBP的进化树分析显示,PBP/GOBP被分成5个不同的分支:Group1、2、3、4和5;每一分支内的同源基因间具有较高的氨基酸一致性(>55%),但不同分支间的一致性较低(<50%)。选择压力分析表明,每一分支内的PBP/GOBP都经过强的负选择(ω<0.70),暗示这些同源基因具有保守的功能。另外,对斜纹夜蛾、棉铃虫和烟青虫的分析表明,每种昆虫的3个PBP均位于同一条染色体上,且彼此临近(相隔2.3～4.0 Kb),因此很可能由一个共同祖先通过基因复制而产生。进一步对斜纹夜蛾的分析显示,GOBP2与3个PBP也紧密相邻位于同一条染色体上(与临近PBP相隔2.6 Kb),暗示GOBP2和3个PBP来自同一个祖先。3种昆虫中PBP及PBP和GOBP在染色体上的这种分布也与非夜蛾科昆虫家蚕、君主斑蝶等相一致,暗示鳞翅目昆虫PBP/GOBP具有相似的进化过程。3.两种灰翅夜蛾属昆虫PBP的功能分化研究在夜蛾科昆虫中,成虫两性间的通讯主要由雌虫释放性信息素来远距离吸引雄虫,而雄虫则依靠其发达的嗅觉器官--触角来感受性信息素并产生趋向雌虫的定向飞行,因此分析PBP的组织表达谱和雌雄差异可为功能研究提供重要信息。利用RT-PCR和qPCR对两种昆虫(甜菜夜蛾和斜纹夜蛾)各3个PBP的测定结果显示,所有PBP均主要在成虫触角中表达,但部分基因在其他组织中也有微量表达;不同PBP在两性触角间的相对表达量明显不同:PBP1为雄性显著高表达(甜菜夜蛾是5.96倍;斜纹夜蛾是2.70倍);PBP2和PBP3雌雄间差异不明显(差异小于2.50倍)。另外,不同PBP在同性触角间的相对表达量也有不同:在雄性触角中,PBP1表达量最高、PBP3最低(甜菜夜蛾中PBP1:PBP2:PBP3 = 16.5:1.5:1.0;斜纹夜蛾中PBP1:PBP2:PBP3 =10.0:3.3:1.0);在雌性触角中,3个PBP表达水平相当(甜菜夜蛾中PBP1:PBP2:PBP3=1.1:1.1:1.0;斜纹夜蛾中PBP1:PBP2:PBP3 = 2.5:1.6:1.0)。由此推测,PBP1在雌蛾性信息素的感受中起主要作用,PBP2和PBP3则起次要作用。进一步利用原核表达系统、亲和层析技术和荧光竞争性结合实验,测定了不同PBP对性信息素组分的结合能力。结果发现,3个PBP均能够不同程度地结合性信息素组分,但以PBP1的结合能力最强、PBP3最低,与3个PBP的雌雄表达差异及在雄虫触角中的相对表达量相一致。此外,3个PBP均选择性结合部分植物气味,且具有较高的亲和力(解离常数Ki<10.0μM)。综上结果,两种夜蛾科昆虫中3个不同的PBP已产生明显的功能分化:PBP1在雌蛾性信息素的感受中起主要作用,PBP2和PBP3的作用次要;除感受雌蛾性信息素外,PBP可能还参与植物气味的感受。4.两种灰翅夜蛾属昆虫GOBP的功能分化研究鳞翅目昆虫均含有2个不同的GOBP基因,且在不同种间非常保守,GOBP通常被认为在植物气味的感受中起作用。为了研究2个GOBP的功能及其差异,对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的各2个GOBP基因的表达谱、气味结合特性以及参与配基结合的关键氨基酸进行了系统分析。qPCR结果表明,2个GOBP主要在成虫触角表达,且在雌雄触角间的表达水平相当(差异均小于2.0倍)。进一步的配体结合实验结果表明,GOBP1能够中等强度地结合大部分被测植物气味(Ki=10～50μM);而GOBP2仅对部分植物气味具有较高的亲和力(Ki<5.0μM)。有意思的是,对于性信息素组分及其类似物,GOBP2也有很强的结合能力(Ki<1.5μM),GOBP1则没有。分子对接结果显示,斜纹夜蛾的GOBP1和GOBP2与配基的结合涉及到不同的关键氨基酸位点;甜菜夜蛾的GOBP2和PBP1与性信息素的结合具有不同的配基结合机制。综上所述,两种夜蛾科昆虫的2个GOBP具有不同的功能:GOBP1和GOBP2对应不同的植物气味谱;除植物气味外,GOBP2可能还参与性信息素的感受。5.两种灰翅夜蛾属昆虫PBP的多聚体存在形式研究在家蚕、舞毒蛾等蛾类昆虫中,通过对PBP与气味分子复合物的晶体结构分析,发现PBP以同源或异源二聚体的形式参与配基的结合,以此来提高PBP对气味感受的特异性或敏感性。为了研究两种昆虫中3个PBP的多聚体存在形式,以纯化的甜菜夜蛾3个PBP、斜纹夜蛾PBP1蛋白和交联剂戊二醛为材料,利用化学交联技术分别研究了SexiPBP1、SexiPBP2、SexiPBP3或SlitPBP1的相互作用。结果表明,0.5%的戊二醛浓度、30 min的交联反应时间和1.0 mg/mL的蛋白浓度是SexiPBP与戊二醛反应的最佳条件。在没有戊二醛存在的条件下,3个SexiPBP均主要以单体的形式存在(95%),能够形成少量二聚体(5%),但没有三聚体形成;在加入一定浓度的戊二醛后,3个SexiPBP形成二聚体的比例增加(9%),并有一定比例的三聚体形成(1%)。类似的结果在斜纹夜蛾的PBP1中也有发现。另外,在不同pH条件下,SexiPBP以单体、二聚体和三聚体混合物的形式存在,但不同pH间三者的比例并没有明显的变化。综上结果,两种昆虫PBP很可能还以同源多聚体的形式结合环境中多样性的气味分子。综上所述,甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的PBP/GOBP很可能通过基因的复制而起源于一个共同的祖先;但无论在两个亚家族间还是亚家族内不同成员间在功能上均已产生明显的分化;特别是PBP可能还参与植物气味的感受,而GOBP2参与性信息素的感受。本研究进一步明确了夜蛾科PBP/GOBP的进化关系和功能分化,同时为基于嗅觉调控的环境友好型害虫防治新技术的设计和开发提供重要依据。