谷胱甘肽在人体内具有多种重要生理功能,在临床药品、保健品、美容等领域应用广泛。作为目前工业化生产谷胱甘肽的主要方法,微生物发酵法存在产量较低、下游工艺复杂、产物胞内抑制等问题。酶法生产谷胱甘肽转化效率高,有望实现谷胱甘肽的高浓度累积,但反应必需的供能物质ATP价格较高,且酶通常存在稳定性差和重复使用性差等限制。因此选择合适的谷胱甘肽合成酶体系、构建高效的ATP再生系统和引入恰当的双酶固定化方法是当下亟需解决的问题。本论文构建了一个经济、高效、稳定的双酶体系来催化合成谷胱甘肽,以双功能谷胱甘肽合成酶（Gsh F）合成谷胱甘肽,引入多聚磷酸激酶（PPK）来循环再生ATP,分别对Gsh F和PPK的表达条件、双酶催化工艺以及双酶固定化技术进行了研究。首先,构建了重组大肠杆菌表达系统,成功表达出具有酶活力的Gsh F和PPK,其次对两种酶的表达条件和酶学性质进行了优化和研究。最佳表达条件为:0.2 m M IPTG,20℃培养16 h,Gsh F酶活为1.68 U/m L,提高0.34倍,PPK酶活为114.06 U/m L,提高1.22倍。利用Ni-NTA亲和层析纯化后,Gsh F酶活达到11.67 U/m L,相比粗酶提高了6.48倍,同时热稳定性也得到提高。其次,对双酶催化体系中的各项参数条件进行优化和探究,更好的协调了谷胱甘肽的生产和ATP的循环,提高了双酶催化效率和谷胱甘肽产率。以低成本的六偏磷酸钠作为ATP再生的磷酸供体,ATP的添加量为反应所需的0.25%时即可驱动谷胱甘肽的连续合成,双酶催化体系最高可实现ATP再生248次。经过条件优化后,在添加120 m M半胱氨酸底物的基础上,GSH产量在3 h时可达到31.92 g/L,转化率为86.56%。最后,开发了一种基于微生物谷氨酰胺转氨酶（MTG酶）交联技术的双酶固定化方法。通过在Gsh F和PPK的N端融合肽链标签,为MTG酶提供了反应性残基和特定交联位点。此外,引入BSA作为保护蛋白参与到交联体系中,制备了具有高酶活保留的交联酶CLEs-BSA,并且交联酶的热稳定性、催化效率和操作稳定性明显好于游离酶。CLEs-BSA可稳定使用7次,在GSH合成体系中可以使底物转化率达到95.56%,重复利用5次后转化率仍有84.67%。