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神经退行性疾病是医学研究领域中的一大难题。研究发现,炎症反应、氧化应激、线粒体机能障碍、兴奋性毒性及细胞凋亡等机理在神经细胞死亡过程中起重要作用。这些研究结果为我们寻找神经退行性疾病的防治药物提供了分析的途径和作用靶点。通过这些研究很有可能找到治疗神经退行性疾病的新型药物。
CH03是中国医学科学院药物研究所合成的全新结构小分子化合物,自主知识产权专利正在申请中。本实验室前期研究发现CH03对多种诱导剂(神经退行性疾病相关)所致神经细胞损伤均具保护作用,并且发现其对H2O2损伤神经细胞的保护作用最为明显,所以推测其发挥作用可能与抗炎、抗氧化有关。
因此,本课题拟在前期研究基础上,进一步探讨CH03对其它诱导剂所致神经元损伤的影响,及其抗炎作用和相关机制。本研究主要分为以下两部分内容:
1.化合物CH03的神经保护作用研究
方法:在体外采用去血清、低糖低氧、AB25-35、谷氨酸损伤PC12细胞,考察CH03对其保护作用;在体内采用东莨菪碱诱导小鼠学习记忆障碍,通过避暗实验、水迷宫实验检测CH03对其学习记忆的改善作用。采用免疫印迹检测小鼠脑皮层组织中Bcl-2、Bax的表达。
结果:体外研究发现,CH03对去血清、低糖低氧、AB25-35模型PC12细胞具有显著的保护作用,并具有一定的量效关系;但CH03对谷氨酸损伤PC12的作用不明显。体内研究发现CH03可显著降低避暗实验中逃避潜伏期、减少错误次数;缩短水迷宫实验中逃避潜伏期、减少错误次数,并且CH03明显增加脑皮层Bcl-2的表达,提示CH03通过保护神经细胞而改善小鼠学习记忆障碍。
上述结果提示,CH03可通过神经保护作用而改善学习记忆障碍。
2 CH03抗炎作用及其相关作用机制研究
方法:抗炎作用:在细胞水平上,采用LPS刺激小胶质细胞BV-2,通过形态观察、ELISA法、Gress法等多种方法评价CH03抗炎作用。作用机制:采用自由基检测试剂盒,观察CH03对自由基的直接清除作用;应用ROS检测试剂盒检测CH03对胞内ROS的抑制作用;也应用免疫印迹、免疫荧光法观察CH03对LPS激活BV-2的炎症信号通路的影响。
结果:CH03可以显著减轻LPS所致BV-2细胞的激活,减少炎症因子TNF-α、IL-1β的释放,降低NO的释放等。作用机制研究表明,CH03显著降低胞内ROS水平,CH03显著抑制LPS诱导的BV-2细胞中炎症相关蛋白COX-2、iNOS、IL-6的表达,亦可以抑制IкB、ERK的磷酸化,抑制NF-кB核转位。
上述结果提示,CH03通过直接清除自由基,通过抑制ERK、NF-кB信号通路的激活,进而抑制炎性蛋白的表达、炎症因子的释放,最终达到抗炎作用。
综上所述,本论文通过体外神经细胞保护作用的筛选及体内改善认知功能的药效学作用的评价,发现CH03具有改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用。并且发现具有抗炎抗氧化的作用,这可能是其保护神经元、改善学习记忆障碍的机制之一。因此,本论文对CH03药理作用及机制进行的研究为其作为抗神经退行性疾病新药开发提供了实验基础。